超顺磁性纳米铁标记大鼠骨髓基质干细胞的实验研究

张 旭 鹿 蕾 张 勉 张 婧 王艳丽 王美青

第四军医大学口腔医学院解剖生理学教研室，陕西西安 710032

用干细胞移植治疗疾病是当今医学研究的热点之一[1-2]，但移植后如何从受体辨别供体细胞，并观察其在活体内的生存迁徙情况，一直是困扰其临床应用的瓶颈之一[3]。超顺磁性纳米铁粒子（superparamagnetic iron nanoparticle，SPIO）可作为磁共振成像分子探针标记骨髓基质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）[3]，从而能够检测活体内细胞的迁徙、代谢和生物学行为。本实验以超顺磁性纳米铁粒子标记大鼠BMSCs，检测其对细胞生物学特性的影响并探讨不同浓度SPIO标记大鼠BMSCs的生物学特性和生命状态，为BMSCs的活体内示踪研究提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以4周龄雌性SD大鼠（体重约120 g，由第四军医大学动物中心提供）为实验动物，主要试剂：DMEM/F12培养基、复合胶原酶 NB4、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、纳米铁（由哈尔滨医科大学附属第四医院医学影像中心惠赠）、亚铁氰化钾、盐酸。主要仪器：倒置相差显微镜、JENM1220型透射电镜。

1.2 SD大鼠BMSCs的分离培养与鉴定

取大鼠双侧胫骨及股骨，用无血清DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，将冲洗获得的细胞悬液离心，取细胞沉淀，加入适量含10%胎牛血清的低糖型DMEM/F12培养基，置于5%CO2、37°C培养箱中培养。多次换液传代使BMSCs纯化，取第4代细胞进行爬片，4%多聚甲醛固定后行HE染色，光镜下观察。取培养的第5代细胞，吹打为单细胞悬液接种，进行细胞爬片。磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗去培养液，4%多聚甲醛固定15 min，以封闭液（PBS含1%牛血清白蛋白，0.1%Triton）室温下封闭30 min，加入兔抗小鼠 CD45，CD105，CD166，CD90 抗体 4°C 过夜后室温30 min，PBS洗涤3次，每遍5 min，然后以CY3联抗兔抗体室温下避光孵育 1 h，DAPI室温（1∶500）染核 5 min，PBS洗涤3次，每遍5 min，加荧光保护剂，激光共聚焦观察 CD45、CD105、CD166、CD90 的表达。

1.3 SPIO标记BMSCs的制备与鉴定

1.3.1 SPIO-BMSCs制备

取对数生长期的BMSCs，反复吹打成单细胞悬液。以5×105/mL的密度接种到含有不同浓度SPIO的20%胎牛血清DMEM/F12培养基中孵育。SPIO浓度分别为15、25、50 mg/L，5%CO2、37°C 培养 48 h。 不含 SPIO 的 20%胎牛血清培养基为对照。

1.3.2 SPIO-BMSCs鉴定

1.3.2.1 普鲁士蓝染色 用不同浓度SPIO标记的BMSCs制备细胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，放入Pearl液（含2%亚铁氰化钾和6%盐酸溶液）中常温孵育30 min，蒸馏水洗涤，显微镜下观察。以未标记细胞作对照。

1.3.2.2 透射电镜检查 标记后BMSCs经0.25%胰蛋白酶消化，1500 r/min离心10 min后弃上清液，向细胞沉淀中加入2.5%戊二醛液固定30 min，再用1%锇酸固定30 min，0.5%醋酸铀4°C染色固定过夜，梯度乙醇脱水，EP812包埋。超薄切片，醋酸铀复染，透射电镜观察。

1.4 SPIO-BMSCs的生物学特性检测

1.4.1 SPIO-BMSCs的存活

分别将15、25、50 mg/L浓度SPIO标记培养的第4代BMSCs单细胞悬液与台蓝染色液以9∶1的比例混匀，静置3 min，光镜下计数，死细胞为蓝色，活细胞不着色，计数200个细胞，计算活细胞百分比。设未标记SPIO的细胞对照组。

1.4.2 SPIO-BMSCs增殖活性

用MTT法绘制生长曲线，将各浓度的SPIO标记前后的细胞悬液接种于96孔板，每孔200 μL，设5个复孔。分别于第 1、3、5、7 d 取 5 孔，加入 MTT 液，在 5%CO2、37°C培养4 h后取出，小心吸弃孔内培养上清，每孔加入150 μL DMSO。振荡10 min，用酶标仪在490 nm处侧出吸光度A值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行处理。计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用方差分析，两两比较用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长情况

原代细胞48 h半换液，见大量悬浮细胞，在瓶底可见单个细胞贴壁生长，多为短多角形。个别细胞伪足伸长，4 d全量换液，PBS漂洗，去除大量漂浮的细胞，可见分散的BMSCs成簇生长为集落状，细胞逐渐转变为长梭形，纺锤状，胞核为圆形或椭圆形，胞浆内可见较多的颗粒（图1a）。10 d左右细胞大部分融合，达90%以上，细胞形态均匀，长梭形，排列紧密，呈旋涡状，有一定的方向性。传代后，细胞形态类似纤维状，排列更加整齐（图1b）。

2.2 BMSCs的免疫荧光鉴定

BMSCs经免疫荧光染色，绝大多数细胞呈CD105、CD166、CD90（间质干细胞特征性标志物）阳性，CD45呈阴性。见图2。

2.3 SPIO-BMSCs标记鉴定

2.3.1 普鲁士蓝铁染色

普鲁士蓝染色见细胞染色阳性率＞99%，表现为细胞内有大量蓝染颗粒，部分聚集成团，颗粒分布以核周和靠近细胞膜处较为明显（图3）。

2.3.2 透射电镜检查

透射电镜观察标记的细胞胞质内见高电子密度颗粒聚集，主要位于各级溶酶体内（图4）。

2.4 SPIO-BMSCs活性

2.4.1 台蓝染色SPIO-BMSCs活细胞计数

实验组1的SPIO浓度为15 mg/L时，活细胞比率与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），但在实验组2和实验组3，当SPIO浓度为25、50 mg/L时活细胞比率有所降低（P ＜ 0.05）。 见表1。

2.4.2 细胞增殖活性检测

MTT结果显示，SPIO的浓度为15 mg/L时对细胞增殖无明显影响（P＞0.05），而当SPIO的浓度为25、50 mg/L时，细胞增殖受到明显抑制（P＜0.05）。见图4。

表1 实验组与对照组的活细胞比率结果（%，±s）

表1 实验组与对照组的活细胞比率结果（%，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d实验组1实验组2实验组3对照组98.12±0.21 95.76±0.36*92.11±0.21*97.98±0.24 97.86±0.21 94.49±0.56*93.12±0.31*98.11±0.21 97.43±0.28 93.12±0.19*91.12±0.67*96.98±0.65 96.82±0.19 94.89±0.76 92.43±0.37*95.67±0.34 98.21±0.67 93.43±0.46*90.98±0.43*96.94±0.54 97.12±0.31 94.29±0.19*91.01±0.54*97.32±0.34

3 讨论

骨髓间充质干细胞在体外特定的诱导条件下或体内特定环境下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、骨髓基质、肌腱及韧带等组织[4]。BMSCs具有定向迁移至损伤部位进行增值、分化、并修复损伤组织的能力[5-7]。骨髓间充质干细胞取材容易，对机体损伤小，且体外培养简单，细胞扩增速度快，由于自体移植无明显的免疫排斥反应，也不涉及伦理道德问题，具有良好的临床应用前景，目前在组织工程、基因工程等研究中成为理想的种子细胞，在临床疾病的治疗过程中，对白血病、神经损伤、癌症的治疗具有很高的医疗价值。

应用外源性BMSCs治疗后如何明确其疗效是目前尚需解决的关键难题之一，SPIO是近年国外开始推广应用的一种标记细胞的对比剂，它利用干细胞吞噬能力，通过简单的体外培养，干细胞就会吞噬目该颗粒，对细胞进行活体的示踪研究，取得了很理想的成果[8]。本实验所用的SPIO是由Fe3O4和Fe2O3组成，是一种不需要转染剂的SPIO。由于化学结构的特殊，即使在较弱的外磁场中也可以产生巨大的磁性，而外磁场撤销后磁性也迅速消失，即所谓超顺磁性[9]。成为目前最常用的MRI监测的负性对比剂，应用于多种细胞的标记，以及标记后体内移植的活体示踪研究。但是对于细胞的毒副作用主要来自于细胞体内铁的含量，如何确定Fe浓度的安全有效范围成为我们研究的重点，一般文献中常用的SPIO标记细胞的浓度，通常在10～50mg/L。但是有研究指出20 mg/L铁已经达到了标记干细胞所需要浓度的最高限，在此浓度阈值孵育过夜，细胞标记率超过97%。然而Fe的浓度达到50 mg/L，细胞的生物学特性、增殖能力、迁移能力就会受到不同程度的抑制。Ben等[10]研究发现，细胞内过多的游离的铁能使细胞的氧化作用加强，产生过多的氧化产物和羟基自由基，细胞容易受到损伤，增殖活性降低，甚至细胞出现坏死的现象。这与本实验浓度25 mg/L组的台盼蓝活细胞计数及MTT比对照组明显降低，这与高浓度Fe抑制干细胞的增殖，活性降低互相吻合。本实验的初步结果显示浓度为15 mg/L的SPIO标记后的BMSCs生长状态与对照组无差异，能够保持原有的细胞状态，形态均匀，呈长状，排列紧密，传代融合时间与对照组一致，台盼蓝活细胞计数实验及MTT细胞增殖检测都证明了标记后的细胞仍具有良好的生物学活性和正常的增殖能力。I ttrich等[11]研究结果也证实低浓度的Fe不会对细胞生命产生影响。因此，SPIO浓度为15 mg/L可安全高效标记BMSCs，为活体示踪提供较好的技术方法，可用于对BMSCs在体内迁移、分化相关研究的示踪。

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