土茯苓含量测定分离度和理论板数的调整

北京市东城区药品检验所（100027）赵希贤 尤立华 杨秉呼 侯扬 叶萌 杨燕宁 聂然

在药品检验含量测定时，高效液相色谱法是常用的方法，药品标准在含量测定项下对理论板数有明确规定；《中国药典》附录高效液相色谱法中对分离度也有规定，“除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。”这些规定保证了待测成分测定结果的准确。但由于色谱柱的长期使用，柱效降低，或者样品中成分复杂，某些成分变化，待测成分经过色谱柱后与其他成分不能完全分离，导致理论板数或分离度不符合规定。笔者在测定土茯苓药材落新妇苷的含量时，针对待测成分落新妇苷与其他成分不能完全分离、理论板数低的情况，按照《中国药典》规定，对高效液相色谱的流速、柱温、进样量等进行调整，采用不同品牌的色谱柱进行比较，测定结果表明，色谱条件中如果选择合适的流速、柱温、进样量，可改变待测成分的保留时间（tR），提高理论板数（N）、分离度（N）等，使之符合要求，保证了测定结果的准确可靠。

1 仪器与试药

WATERS2695液相色谱仪；落新妇苷对照品（批号：111798-201102）；土茯苓对照药材（批号：121439-200401，由中国药品生物制品检定所提供）；试剂为分析纯，甲醇为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 土茯苓中落新妇苷的含量测定方法色谱条件、对照品溶液制备及供试品溶液制备采用《中国药典》土茯苓[含量测定]项下方法。

附表1 不同品牌色谱柱对保留时间、分离度、理论板数的影响

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%冰醋酸溶液（39∶61）为流动相；检测波长为291nm。理论板数按落新妇苷峰计算应不低于5000。

2.1.2 对照品溶液的制备 取落新妇苷对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过二号筛）约0.8g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入60%甲醇100ml，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 不同品牌色谱柱对保留特性的影响 采用不同品牌色谱柱进行测定，色谱柱分别为DiscoveryC18（150mm×4.6mm，5μm）和WondasilC18（150mm×4.6mm，5μm），进样量为10μL，流速为0.7ml/min，柱温为30℃，按照土茯苓中落新妇苷的含量测定方法，测定保留时间、分离度、理论板数，数据结果见附表1。

附表2 不同流速对保留时间、分离度、理论板数的影响

附表3 不同进样量对分离度、理论板数的影响

附表4 不同柱温对保留时间、分离度、理论板数的影响

不同品牌色谱柱在测定土茯苓中的落新妇苷时，保留时间、分离度、理论板数不相同，其中DiscoveryC18分离度较差，分析原因为此柱已使用较长时间，但理论板数均符合规定。

2.3 不同流速对保留特性的影响 采用DiscoveryC18色谱柱，进样量为10μL，流速分别为0.3ml/min、0.5ml/min、0.7ml/min、1ml/min，柱温为30℃，按照土茯苓中落新妇苷的含量测定方法，测定保留时间、分离度、理论板数，数据结果见附表2。

调整流速可改变测定成分的分离度，流速减少，可使保留时间增加，分离度提高，理论板数增加，可通过减少流速的办法提高分离度和理论板数；但流速的增加与保留时间的减少呈倒数关系，流速减少多少倍，保留时间增加相同的倍数，即减少流速导致测定时间增加。

2.4 不同进样量对保留特性的影响 采用WondasilC18色谱柱，进样量分别为1μL、2μL、5μL、10μL、15μL，流速为0.7ml/min，柱温为30℃，按照土茯苓中落新妇苷的含量测定方法，测定分离度、理论板数，数据结果见附表3。

进样量减少，对提高分离度、理论板数效果不明显，分离度、理论板数只是略微提高，分析原因发现WondasilC18色谱柱为新使用的色谱柱，当更换为使用过一段时间的色谱柱如DiscoveryC18色谱柱进行测定时，分离度改变较大。以流速为0.7ml/min，柱温30℃，分别测定进样量为5μL、10μL时的分离度，则进样量5μL时，分离度达到1.54，符合药典规定；而进样量为10μL时，分离度只有1.47。因此减少进样量可以提高分离度，尤其是对于使用过一段时间的色谱柱，进样量的调节对分离度影响较明显。

2.5 不同柱温对保留特性的影响 采用WondasilC18色谱柱，进样量为5μL，流速为0.7ml/min，柱温分别为25℃、30℃、40℃、50℃、60℃，按照土茯苓中落新妇苷的含量测定方法，测定保留时间、分离度、理论板数，数据结果见附表4。

柱温不同，可显著改变待测成分的保留时间、分离度与理论板数。柱温升高，保留时间减少，分离度降低，理论板数升高（柱温60℃时待测成分因与别的峰合在一起，峰宽加大而致理论板数降低），因此，若欲提高分离度可采用降低柱温的方法，而欲提高理论板数可采用升高柱温的方法。

3 讨论

测定土茯苓中落新妇苷的含量[1][2]，调整色谱条件，流速和柱温对保留时间、分离度、理论板数影响较大，进样量多少对于新使用的色谱柱的分离度影响较小，对使用过一段时间的色谱柱影响稍大。因此当测定土茯苓中落新妇苷的含量时，如果分离度低，不符合规定，可采用降低柱温，降低流速，减少进样量等方法，改善分离度；如果理论板数低，不符合规定，可采用升高柱温，降低流速的方法，可显著增加理论板数。

在实际检验时，更换色谱柱可解决分离度问题。但更换色谱柱缺点较多，不仅增加了换柱平衡所需的时间，且需多备色谱柱，增加检验成本，增加冲洗色谱柱的有机溶剂。所以多选择调整柱温、流速、进样量的方法，使分离度、理论板数符合规定。

《中国药典》附录高效液相色谱法规定：正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。因此在实际检验工作中，可通过调整高效液相色谱条件，获得满意的保留时间、分离度和理论板数，更好地提高检验效率，保证检验结果的准确。