HPLC法测定抗骨增生片中芒柄花素的含量

江苏省盐城市药品检验所（224002）周会芹 郑灏 支荣荣

抗骨增生片是由熟地黄、鹿衔草、骨碎补、鸡血藤、淫羊藿、肉苁蓉、莱菔子7味药组成的中药复方制剂，其中鸡血藤为豆科（Leguminosae）密花豆属植物密花豆（SpatholobussuberectusDunn.）的干燥藤茎，其性温，味苦、甘，归肝、肾经，具有补血、活血、通络之功效，用于治疗月经不调、血虚萎黄、麻木瘫痪、风湿痹痛等症。据文献报道，鸡血藤主要含有三萜和黄酮类成分，芒柄花素[1]是其中黄酮类成分之一，具有抗菌[2]、抗骨质疏松等作用。目前，已有测定抗骨增生片中淫羊藿苷和柚皮苷[3]含量的报道，但尚未有测定抗骨增生片中芒柄花素含量的文献报道，本文采用反相高效液相色谱法测定了抗骨增生片中芒柄花素的含量。经方法学验证，该方法具有良好精密度、重复性和稳定性，可用于抗骨增生片的质量控制。

1 仪器与试药

高效液相色谱系统：Agilent 1200 Series高效液相色谱仪（G1311A四元泵高效液相色谱仪，G1316A柱温箱，G131413紫外检测器，G1322A真空脱气机），Agilent 1200色谱工作站，XS205电子天平（梅特勒托利多公司）。乙腈为色谱纯，水为娃哈哈饮用纯净水，其他试剂均为分析纯。芒柄花素对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号为111703-200602，供含量测定用。抗骨增生片由太极集团四川绵阳制药有限公司、陕西盘龙制药集团有限公司、广东罗浮山国药股份有限公司和山西华康药业股份有限公司提供（批号为55120009，55110003，20120601，L12I031，20110402）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

附图 对照品、样品、阴性对照图谱

2.1.1 对照品溶液 精密称取芒柄花素对照品12.12mg，置25ml量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配得0.4848mg/ml的对照储备液，精密量取上述对照储备液1.0ml，置于10ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

2.1.2 供试品及阴性样品溶液 精密称取本品及阴性样品粉末各0.2g（0.4g/片），置锥形瓶中，加入75%甲醇30ml，加热回流1h，过滤，用75%甲醇适量清洗残渣和容器，蒸干，用75%甲醇溶解，移置5ml量瓶中，摇匀，滤过，即得供试品溶液（0.45μm微孔滤膜过滤后进样）。

2.2 色谱条件 色谱柱： Agilent C18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈－0.5%磷酸（35∶65）；流速：1.0ml/min；检测波长：248nm；柱温：30℃；进样量：10μl；分析时间：18min。在上述色谱条件下，芒柄花素可达到基线分离，阴性样品色谱中在与芒柄花素保留时间相同的位置没有色谱峰的干扰，表明该方法有较强的专属性；经计算得理论塔板数为10000。见附图。

2.3 线性关系考察 精密量取对照品储备液1.0ml，3.0ml，5.0ml，7.0ml，10.0ml，分别置入50ml量瓶中，分别用甲醇稀释至刻度，配成系列对照品溶液，按上述色谱条件进样测定峰面积。以峰面积Y对浓度X（μg）绘制标准曲线。结果表明，芒柄花素进样浓度在0.099～0.994μg范围内，线性关系良好，回归方程为Y＝-2.61473338＋67138.99773710X，R＝0.9999。

2.4 精密度试验 取对照品溶液按“2.2”项色谱条件下连续进样6次，记录色谱峰面积。结果芒柄花素峰面积的RSD（n＝6）为0.1%。

2.5 检测限及定量限测定 将芒柄花素色谱峰的信号与基线信号进行比较，以信噪比约3∶1注入仪器的量定为检测限，以信噪比约为10∶1时注入仪器的量确定为定量限。芒柄花素的检测限为0.006μg/ml，定量限为 0.02μg/ml，进样量为10μl。

2.6 稳定性试验 取1号样品供试品溶液分别在0h，2h，4h，8h，16h，24h按“2.2”色谱条件进样测定，芒柄花素峰面积的RSD为0.89%，说明供试品溶液在24h内稳定。

2.7 重复性试验 取同一样品（批号为55120009），按供试品溶液制备项下操作，平行制备6份，在上述色谱条件下进行分析测定，结果芒柄花素含量的平均（n＝6）为5.85mg/片，RSD为0.73%，表明重复性良好。

2.8 回收率试验 取已知含量（5.85mg/片，平均片重0.4023g）的样品（批号55120009）6份，每份0.1g，精密称定，分别精密加入芒柄花素对照储备液3ml（1.4544mg），每一浓度3份，按“2.1.2”操作，在“2.2”色谱条件下进行分析，计算低、中、高浓度芒柄花素的回收率，见附表1。

2.9 样品测定 分别取5个批号的抗骨增生片，每个样品取2份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液10μl，在上述色谱条件下进样分析，测定峰面积，用外标法计算出芒柄花素含量，见附表2。其中采用248nm的色谱图基线更稳，干扰少，故选择248nm作为检测波长。

3 讨论

3.1 波长的选择 结合相关文献发现，测定芒柄花素含量大多使用248nm和254nm，

附表1 加样回收试验

附表2 抗骨增生片中芒柄花素的含量（n＝2）

3.2 流动相的选择 分别考察了乙腈-水系统和乙腈-0.5%磷酸系统作为流动相，结果表明，以乙腈－0.5%磷酸溶液为流动相，所得色谱峰峰形好，分离效果佳。故选择乙腈-0.5%磷酸系统作为流动相。

3.3 提取工艺的考察 以芒柄花素的含量为指标考察提取工艺。采用超声法分别考察甲醇、乙醇的提取效率，结果表明甲醇的提取效率较高。又以甲醇为提取溶剂，分别考察了超声法和回流法的提取效率，结果表明回流法的提取效率优于超声法，故采用回流法。又采用回流法分别考察了体积分数为60%甲醇、体积分数为75%甲醇、体积分数为100%甲醇的提取效率，结果表明体积分数为75%甲醇的提取效率最高。采用单因素循环方法，进一步考察了溶剂倍数、提取时间和提取次数3个因素，最后选择的最佳提取工艺为30倍量体积分数为75%甲醇回流1h提取1次。

3.4 样品的处理方式 考察了未使用0.45μm薄膜过滤和使用薄膜过滤的样品，发现过滤过的样品所得色谱峰峰形好，分离效果佳，杂峰较少。

3.5 小结 本文建立的方法能准确地测定抗骨增生片中芒柄花素的含量，且该方法简便、可靠、重复性好；同时本文测定了5批抗骨增生片中芒柄花素的含量，结果含量最大值为5.85μg/ml，最小值为0.95μg/ml，平均值为2.64μg/ml，为制定含量限度提供了依据。