水蛭素抗皮肤瘢痕的体内外实验研究

农晓琳，陈 洪，李佳荃，陈石海，邓 凌，唐黎黎，李菊裳

1广西医科大学口腔医学院口腔颌面外科;2广西大学医学科学实验中心;3广西大学第一临床医学院整形美容科;4广西大学第一临床医学院皮肤性病科，南宁 530021

人皮肤瘢痕的形成主要是由于成纤维细胞的过度增殖。因此，抑制皮肤瘢痕成纤维细胞的生物学行为是防治瘢痕形成的关键，但目前对于皮肤瘢痕的药物治疗大多仅限于基础研究，未能广泛应用于临床。水蛭素(Hirudin)是凝血酶的特异性抑制剂，有研究发现水蛭素可以抑制细胞的增殖［1］。本实验通过对人皮肤成纤维细胞的体外培养和兔耳增生性瘢痕模型的建立，观察水蛭素对人皮肤瘢痕成纤维细胞增殖的影响以及自制的水蛭素膏剂对兔耳瘢痕的抑制作用，为临床应用水蛭素治疗皮肤瘢痕提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、胰蛋白酶、二甲基亚砜DMSO(美国Sigma公司);细胞凋亡原位检测试剂盒(美国Roche Diagnostics);白凡士林、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、甘油均购自南宁拜尔公司;十八醇、对羟基苯甲酸乙酯(广西西陇化工有限公司);天然水蛭素由广西医科大学药学院提供;

1.2 仪器与设备

ELX-800型酶标仪(美国宝特公司);病理图象分析仪(型号:DMR+Q550，德国)。

1.3 细胞来源

瘢痕组织标本供体均来自广西医科大学整形外科的患者，纳入标准为近期未使用瘢痕抑制药物，不伴有其他系统性疾病，取材前均经患者知情同意。前后共培养6例瘢痕患者的皮肤成纤维细胞，其中男3例，女3例，瘢痕增生时间在1～3年左右。

1.4 方法

1.4.1 人皮肤瘢痕成纤维细胞的原代培养及鉴定

在无菌条件下采集手术切除的皮肤瘢痕组织后立即放入含500 U/mL青霉素和500 mg/L链霉素的培养基中。无菌条件下用手术刀片和剪刀去除表皮和基底层，用D’hanks液将标本反复洗涤。将清洗干净的皮肤瘢痕组织剪成3×3×2 mm大小的组织块。将组织块移入50 mL培养瓶中，均匀地贴在瓶壁上，间距约1 cm。瓶内加入含有15%胎牛血清的DMEM培养基1.5 mL，密闭瓶口。2 d以后再补加3～5 mL培养液，此后3～4 d更换一次培养液。待成纤维细胞长满瓶底时以0.25%胰蛋白酶消化传代培养。通过传代去除非成纤维细胞成分，获得人皮肤瘢痕成纤维细胞。本实验取第3～4代的成纤维细胞用于试验。抗波形蛋白抗体免疫细胞化学SP法检测培养获得的细胞。

1.4.2 水蛭素对成纤维细胞的作用

1.4.2.1 MTT法测定水蛭素对人皮肤瘢痕成纤维细胞的增殖影响作用

取对数生长期的人皮肤瘢痕成纤维细胞3～4代，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调为0.5×105/mL，分别接种于96孔塑料培养板，密度为0.5×104个/孔，每孔加入100 μL的细胞悬液和100 μL的培养基，常规培养24 h后吸弃原培养液，实验分组:1、水蛭素组:加入已经配置的含水蛭素浓度为 5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 U/mL的培养基200 μL;2、对照组:每孔只加200 μL 的培养基。每孔设3个复孔。于37℃，5%CO2饱合湿度继续培养24 h后，加入MTT摇匀，继续培养4 h后，加入200 μL DMSO，振荡，待结晶颗粒溶解后，采用酶标仪于490 nm波长下测定吸光度(A)值。记录结果，采用概率单位法(Probit)计算药物的半数抑制浓度(IC50值)。计算药物对皮肤瘢痕成纤维细胞的抑制率。生长抑制率 =(1-A用药组/A对照组)×100%。

1.4.2.2 TUNEL法检测细胞凋亡和凋亡指数(apoptosis index，AI)的计算

将对数生长期的成纤维细胞3～5代用0.25%的胰酶消化后，接种在6孔板上，每孔5×104个细胞，常规培养1 d，待细胞贴壁生长后用水蛭素IC50的浓度作用于成纤维细胞。继续培养1d后将培养基吸出后放入离心管，然后用0.25%胰酶将贴壁的细胞消化后放入同一离心管，1000 rpm离心，5 min收集细胞，0.1%多聚赖氨酸处理玻片后，细胞涂片，室温下自然晾干。晾干后用PBS冲洗2次，40 g/L多聚甲醛室温下固定10 min，PBS冲洗。加入用Tris缓冲盐溶液(TBS)新鲜稀释的蛋白酶K(比例为1∶100)，37℃下作用10 min。蒸馏水洗涤，加入含末端脱氧核苷酸转移酶TdT和地高辛标记的脱氧尿苷5-三磷酸(dUTP)标记缓冲液20 μL，37℃下放置2 h。TBS洗涤，加入封闭液50 μL室温放置30 min，甩干;加 Anti-DIG-Biotin。加 SABC后，采用二氨基联苯胺(DAB)显色20 min，蒸馏水洗涤，苏木素复染，TBS洗涤、脱水、封固。将切片置于200倍光学显微镜下观察，细胞核中有棕色颗粒者为凋亡细胞。用病理图像分析仪在凋亡细胞密集区于400倍镜下连续计数5个视野的凋亡细胞及细胞总数，计算平均阳性细胞率即凋亡指数AI。

1.4.3 水蛭素瘢痕膏剂对兔耳瘢痕的作用

1.4.3.1 兔耳瘢痕动物模型的建立

用3只大耳新西兰白兔，在兔耳双侧腹侧分别做相同的6个直径为1 cm的圆形切口，共作创面36个，完整切除全层皮肤，直至软骨膜。

1.4.3.2 膏剂的制备

基质对照组膏剂的制备:油液:取白凡士林2.4 g、十八醇1.6 g和单硬脂酸甘油酯0.4 g置于蒸发皿中，水浴加热至70～80℃使其熔化，水液:将十二烷基硫酸钠0.2 g、甘油1.4 g、对羟基苯甲酸乙酯0.04 g和计算量的蒸馏水置另一蒸发皿中加热至70～80℃使其溶解，在同温下将水液以细流加到油液中，边加边搅拌至冷凝，即得乳剂型基质，制备基质20 g为对照组膏剂;水蛭素组膏剂的制备:制备膏剂20 g，浓度为7.5%。

1.4.3.3 组别及处理

动物随机平均分为3组，每组12个瘢痕，于术后28 d(创面均已上皮化)，开始对实验组外涂膏剂，每日3次，A组为水蛭素组，B组为单纯基质对照组，C组为不加处理的空白对照组。

1.4.3.4 标本取材及处理

术后56 d，处死动物后切取兔耳瘢痕标本，令标本周边带有少许正常组织。所有取材的标本经瘢痕凸起最高点沿瘢痕最大径方向，将瘢痕分切为2部分，经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制取最大断面切片，行HE染色及VG染色。

1.4.3.5 观察指标

①大体观察;②光镜下观察;③瘢痕增生指数(Hypertrophic Index，HI):HE染色切片于低倍镜下用显微测量标尺测量，按公式HI=A/B(见图1)计算瘢痕增生指数;④成纤维细胞数密度(Numerical density on area，NA):400倍光镜下观察瘢痕HE染色切片，在瘢痕中央浅部、中央深部、两侧部各随机选取5个矩形视野(0.00505 mm2)，目测计数并计算切片内单位面积成纤维细胞数量，结果取均数;⑤胶原纤维的面密度(Area density on area，AA):VG染色组织切片，在瘢痕中央浅部、中央深部、两侧部各随机选取5视野，利用计算机辅助病理图象分析系统计算红染之胶原纤维的面密度，结果取均数。

图1 瘢痕增生指数HI计算示意图Fig.1 Illustration plot for the calculation of hypertrophic index

1.4.3.6 统计学处理

利用SPSS10.0软件，计量资料采用单因素方差分析和t检验，计数资料采用卡方检验。

2 结果与讨论

2.1 人皮肤瘢痕成纤维细胞的体外原代培养及鉴定

7～12 d可见组织块周边细小芽状贴壁细胞爬出，放射状生长，传代后细胞生长旺盛。光镜下细胞胞体狭长、透亮，胞膜清晰，呈典型的梭形和不规则三角形，图2-a;HE染色见成纤维细胞胞浆丰富，色淡紫，胞核大，色蓝，位于细胞中央，图2-b。免疫组化染色抗波形蛋白抗体染色阳性，细胞浆棕色颗粒样着色，提示所得细胞为间叶组织来源，符合成纤维细胞特性。

图2 人皮肤瘢痕成纤维细胞的培养与鉴定Fig.2 Cultivation and identification of skin scar derive fibroblasts

2.2 水蛭素对成纤维细胞的影响

2.2.1 MTT法检测的结果

水蛭素浓度为0.078～5 U/mL时与空白对照组比较对细胞有明显抑制作用(P＜0.01)(表1)，且呈浓度依赖性，水蛭素的浓度越高，对成纤维细胞的抑制率越高，图3。水蛭素对成纤维细胞生长抑制的IC50=0.9 U/mL。

表1 水蛭素对成纤维细胞增殖的影响(±s)Table 1 Effect of hirudin on fibroblast proliferation(±s)

表1 水蛭素对成纤维细胞增殖的影响(±s)Table 1 Effect of hirudin on fibroblast proliferation(±s)

注:水蛭素各组与空白对照组A值相比较，＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，＊＊P ＜ 0.01.

组别(浓度)Grouping and concentration吸光度值Absorbance抑制率(%)Inhibition rate(%)空白对照组Contral group 0.173±0.0012 -水蛭素组1 Hirudin group 1(0.078U/mL) 0.135±0.0040＊＊ 22.1±2.4水蛭素组2 Hirudin group 2(0.156U/mL) 0.134±0.0072＊＊ 22.7±4水蛭素组3 Hirudin group 3(0.313U/mL) 0.117±0.0053＊＊ 32.5±3.3水蛭素组4 Hirudin group 4(0.625U/mL) 0.101±0.0062＊＊ 41.3±3.6水蛭素组5 Hirudin group 5(1.25U/mL) 0.077±0.0046＊＊ 55.6±2.9水蛭素组6 Hirudin group 6(2.5U/mL) 0.066±0.0036＊＊ 61.9±2.3水蛭素组7 Hirudin group 7(5U/mL) 0.041±0.0026＊＊76.3±1.4

图3 水蛭素对瘢痕成纤维细胞增殖的影响Fig.3 Effect of hirudin on the proliferation of scar derive fibroblasts

2.2 TUNEL法检测水蛭素诱导成纤维细胞凋亡的结果

水蛭素实验组，IC50=0.9 U/mL培养的成纤维细胞体积缩小、胞质少、密度变小，凋亡细胞多、呈棕黄色。而空白对照组的成纤维细胞体积大、胞质丰富、密度大，图4。水蛭素实验组培养的细胞AI值高于空白对照组(P＜0.01)，见表2。

Fig.4 Detection of fibroblasts apoptosis induced by hirudin with TUNEL assay(400×)图4 TUNEL法检测水蛭素诱导成纤维细胞凋亡(400×)

表2 TUNEL法检测水蛭素对成纤维细胞的凋亡诱导作用Table 2 Apoptosis of fibroblasts after hirudin treatment(TUNEL assay)

2.3 水蛭素瘢痕膏对兔耳瘢痕作用的结果

2.3.1 大体观察

单纯基质对照组、空白对照组的瘢痕凸出皮缘，色红，水蛭素组较单纯基质对照组和空白对照组的瘢痕平坦、柔软，如图5-1。

2.3.2 光镜下观察

HE和VG染色切片:3组瘢痕均厚于周边正常皮肤，水蛭素组的瘢痕小于对照组。对照组的瘢痕较凸，水蛭素组的瘢痕较对照组的平坦、成纤维细胞较少，胞体减小，胶原纤维较稀疏，排列整齐。对照组的瘢痕胶原纤维红染，排列紊乱(图5)。

2.3.3 增生指数HI

水蛭素组分别与单纯基质对照组及空白对照组相比较有差异有统计学意义(P＜0.01)，而单纯基质对照组与空白对照组相比较，P＞0.05，提示这两组差别无统计学意义，见表3。

图5 水蛭素对兔耳瘢痕模型影响的形态学观察Fig.5 Morphology observation on hirudin oniment treated rabbit ear skin scar model

表3 水蛭素对兔耳模型瘢痕增生指数的影响(±s)Table 3 Hypertrophic index of rabbit ear skin scar model(±s)

2.3.4 瘢痕成纤维细胞数密度NA(靶目标数量/统计场总面积)

水蛭素组分别与单纯基质对照组和空白对照组相比较有显著差异(P＜0.01)，具有统计学意义，见表4。

表4 水蛭素对瘢痕成纤维细胞数密度的影响(±s)Table 4 Numerical density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

表4 水蛭素对瘢痕成纤维细胞数密度的影响(±s)Table 4 Numerical density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

注:水蛭素组分别与空白对照组、基质对照组相比较，P=0.000，＊＊P＜0.01。Note:Hirudin group compare with control and matrix group，＊＊ P ＜0.01.

组别Grouping成纤维细胞数密度(细胞数/mm2)Numerical density on area(cell/mm2)空白对照组Control group 4662.95±485.47基质对照组Matrix group 4771.53±355.93水蛭素组 Hirudin group 3724.846±442.73＊＊

2.3.5 胶原纤维的面密度AA

水蛭素组分别与单纯基质对照组和空白对照组相比较有差异(P＜0.01)，具有统计学意义，见表5。

表5 水蛭素对兔耳瘢痕模型胶原纤维的面密度的影响(±s)Table 5 Area density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

表5 水蛭素对兔耳瘢痕模型胶原纤维的面密度的影响(±s)Table 5 Area density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

注:水蛭素组分别与对照组、基质相比较，P=0.000，＊＊P＜0.01。Note:Hirudin group compare with control and matrix group，＊＊ P ＜0.01.

组别Grouping胶原纤维的面密度Area density on area(%)空白对照组52.58±4.69基质对照组 50.55±5.40水蛭素组 35.55±7.85＊＊

2.4 讨论

瘢痕是在创伤愈合过程中形成的一种皮肤疾患，病理上表现为细胞外基质的过度沉积和成纤维细胞的过度生长［2］。成纤维细胞在瘢痕组织里起主要的作用，因此，抑制瘢痕成纤维细胞的生物学行为是防治瘢痕形成与发展的关键，皮肤瘢痕是一种难治的疾病，目前用于病理性瘢痕治疗的药物主要有激素、硅酮和抗肿瘤药物等，但是这些药物本身的毒副及疗效不确定，使之具有局限性。作者致力于从中药和天然药提取物中筛选抗皮肤瘢痕的功效药物，该方向有较大的研究发掘价值［3-5］。本实验选用水蛭素对皮肤瘢痕成纤维细胞增殖抑制的研究以及对兔耳增生性瘢痕的作用检测其抗皮肤瘢痕增生的疗效并探索相关机理。

水蛭素分为天然水蛭素和人工水蛭素，本实验采用的是天然水蛭素。天然水蛭素是水蛭(蚂蝗)唾液腺的一种分泌物质，为作用较强的凝血酶特异性抑制剂。其由65个氨基酸残基组成，化学结构为单链环肽化合物，与凝血酶结合可形成一种非共价复合物，这种复合物可以中和凝血酶，并且能抑制凝血酶结合的纤维蛋白原［1，6］，能特异性地抑制凝血酶的活性［7］，可调节碱性成纤维细胞因子、转化生长因子β1的分泌［9］，具有多方面的用途。水蛭素可以通过抑制凝血酶诱导的血小板聚集和促进血小板与凝血酶解离，导致血小板不能释放血小板源生长因子(PDGF)，从而抑制细胞增生。PDGF不仅是由血小板分泌的，还可由成纤维细胞等一些细胞产生。本项目组前期研究显示水蛭素可通过抑制成纤维细胞的生长及胶原形成达到对瘢痕的抑制作用［8］，提示其具有进一步深入研究及应用的价值。

本研究采用浓度为0.078～5 U/mL水蛭素作用于皮肤瘢痕的成纤维细胞，MTT法检验发现该浓度范围的水蛭素能抑制成纤维细胞的生长，效果呈剂量依赖性。TUNEL法检测水蛭素的凋亡率，比对照组高。本研究体外实验显示:水蛭素可抑制人皮肤瘢痕成纤维细胞的体外增殖。本研究利用水蛭素配制外用膏剂对兔耳皮肤瘢痕模型作用的初步筛选结果显示:水蛭素组的兔耳瘢痕质地柔软且较平整，无明显的充血情况。测量水蛭素组的瘢痕增高指数、瘢痕成纤维细胞数密度和胶原纤维的面密度，检测显示水蛭素组较对照组和空白对照组的低，差异具有统计学意义。HE染色发现水蛭素组成纤维细胞数量较对照组的少，提示水蛭素可以抑制皮肤瘢痕成纤维细胞的生长。VG染色后观察见水蛭素组的胶原较对照组的稀疏，排列较整齐，水蛭素组的胶原纤维面密度AA较对照组的小，提示水蛭素可以抑制瘢痕组织内成纤维细胞生长和胶原形成，从而抑制瘢痕组织的增生。

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