油菜蜂花粉超临界提取物HPLC-FLD分析及体外清除自由基活性研究

吕欢欢，王小艳 ，王洪伦，索有瑞

1中国科学院西北高原生物研究所，西宁810001;2中国科学院大学，北京 100049

青藏高原平均海拔3000 m以上，高寒、缺氧、昼夜温差大、日照时间长、紫外线辐射强、植物病虫害少等，独特的地理条件和高原气候，十分有利于蜜源植物的生长。青藏高原每年油菜蜂花粉产量约800～1000吨。油菜蜂花粉具有多种生物活性，可用于延缓衰老［1］、治疗和预防癌症［2］、调节免疫功能［3］、降血脂［4］、抗炎抗过敏［5］、抗氧化［6］等。

近年来，由于超临界CO2提取技术低温、无毒、无污染、无溶剂残留等优点的显现，该提取技术已逐渐规模化地应用于医药、食品等领域。本实验室通过超临界设备提取获得的油菜蜂花粉超临界提取物(rape bee pollen supercritical fluid extract，PSFE)主要以油脂的形式存在，其中主要含有脂肪酸。最常见的脂肪酸分析方法是GC-MS法，该方法成本低、速度快，但缺点是灵敏度欠佳、稳定性差、衍生重现性不够理想等。为了明确PSFE提取物中的主要成分及含量，本文采用本实验室自行合成的1，2-苯并-3，4-二氢咔唑-9-乙基对甲苯磺酸酯(BDETS)［7］作为柱前衍生化试剂，利用柱前衍生-高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)法对PSFE提取物进行了成分分析和测定。该方法具有较高的灵敏度。同时，本文对PSFE提取物分别进行了羟基自由基、超氧阴离子自由基和二苯代苦味酰基自由基体外清除效果的考察，以期为青藏高原油菜蜂花粉资源的高附加值开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油菜蜂花粉产自青海省海北州门源县，由青海友林科技发展有限公司提供。将蜂花粉干燥、除杂后，粉碎至粒度为0.6 mm左右作为提取材料。

1，2-苯并-3，4-二氢咔唑-9-乙基对甲苯磺酸酯(BDETS，自制);30种饱和脂肪酸标准品(上海试剂厂);9种不饱和脂肪酸标准品(Sigma公司);色谱纯乙腈(ACN，德国 Merck公司);碳酸钾、氢氧化钾、盐酸、硫酸(分析纯，西安化学试剂厂);甲醇(色谱纯，山东禹城化学试剂厂);N，N-二甲基甲酰胺(DMF)经减压蒸馏后使用;二苯代苦味酰基自由基(Sigma公司);邻二氮菲(上海中秦化学试剂有限公司);L-抗坏血酸(天津市恒兴化学试剂制造有限公司);Tris(成都化学试剂厂);邻苯三酚、双氧水、无水乙醇、七水合硫酸亚铁、磷酸二氢钠、石油醚(沸程60～90℃)、乙酸乙酯、磷酸氢二钠、DMSO均为国产分析纯;纯水由Milli-Q超纯水系统制备。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100型高效液相色谱(Agilent公司)配备四元梯度泵，在线真空脱气机，655-10S型荧光检测器，100位自动进样器;CARY300Bio型紫外-可见分光光度计(美国Varian公司);HA221-50-06超临界CO2萃取装置(南通仪创实验仪器有限公司);CO2纯度为99.99%(西宁大通二氧化碳厂);ALC-1104电子天平(德国Sartorius公司);HH-4恒温水浴锅(国华电器有限公司);电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂);9FZ-19型齿爪式粉碎机(四川省永兴机械厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的制备及其衍生过程

准确取定量脂肪酸标品，用色谱纯乙腈配成1.0×10-2mol/L的溶液。称取8.32 mg BDETS，用DMF定容至10 mL，浓度为1.0×10-2mol/L。相应低浓度的脂肪酸标准液(1.0×10-4mol/L)用色谱纯乙腈稀释而成。向盛有10 mg无水K2CO3催化剂的 1.5 mL 安培瓶中依次加入 400 μL DMF、100 μL混合脂肪酸(1.0×10-4mol/L)、200 μL BDETS溶液，封口后于90℃水浴下振荡反应30 min，放冷后，取出200 μL衍生液加200 μL色谱纯乙腈溶液稀释2倍后摇匀，进样10 μL分析。

1.3.2 HPLC-FLD分析条件

色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C8色谱柱(4.6(150 mm，5 μm)。流动相 A:50%乙腈(色谱纯);流动相B:100%乙腈(色谱纯);流动相D:乙腈/N，N-二甲基甲酰胺 =2/1(v/v)。流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，柱温为30℃。梯度洗脱程序如下:0～20 min，100% ～60%A，0～40%B;20～20.2 min，60 ～45%A，40 ～55%B;20.2 ～40 min，45 ～15%A，55 ～85%B;40 ～60 min，15～0%A，85～100%B;60 ～65 min，100%B;65 ～65.2 min，100～0%B，0～100%D;65.2～85 min，100%D。荧光检测的激发波长为λex=333 nm，发射波长为λem=390 nm。

1.3.3 PSFE样品及各供试液的制备

取经前处理后的油菜蜂花粉装填于超临界CO2萃取装置的萃取釜中，设定萃取釜的萃取条件为:温度45 ℃、压力35 MPa、时间90 min、CO2流量40 kg/h。设定分离釜I的条件为:温度30℃、压力7.0 MPa;分离釜 II的条件为:温度30℃、压力 5.3 MPa。经上述条件萃取得到油菜蜂花粉超临界提取物(PSFE)。

称取0.1 g PSFE提取物(精确到0.0001)，加入3.0 mL DMF后超声摇匀。向盛有10 mg无水K2CO3催化剂的安培瓶中依次加入200 μL DMF，150 μL PSFE 样品溶液，100 μL BDETS 衍生试剂(0.01 mol/L)，封口后于90℃水浴下振荡反应30 min，取100 μL衍生液加入300 μL色谱纯乙腈稀释4倍后摇匀，取10 μL进样，做 HPLC-FLD成分分析。

称取适量的PSFE提取物，用石油醚∶无水乙醇=1∶1(v/v)的溶剂系统溶解得到母液。然后稀释配成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL 5 个浓度梯度的样品溶液，作为体外清除自由基实验的供试液(配置同浓度L-抗坏血酸作阳性对照)。

1.3.4 超氧阴离子自由基清除能力测定［8］

采用邻苯三酚自氧化法。取25℃水浴中预热20 min的5.0×10-2mol/L pH 8.2的 Tris-HCl缓冲液4.5 mL，依次加入1 mL不同浓度的样品溶液(或蒸馏水)及0.4 mL 2.5×10-2mol/L邻苯三酚溶液，立即混匀置25℃水浴中准确反应5 min，然后加入8 mol/L的HCl 1.0 mL终止反应。以Tris-HCl缓冲液作参比，于实验扫描确定的最大吸收波长处测定其吸光度。每个处理均做三个重复，并以同浓度L-抗坏血酸作为阳性对照。对的清除率按如下公式计算:

式中，A1:Tris-HCl缓冲液4.5 mL加蒸馏水1 mL加邻苯三酚溶液0.4 mL;A2:以1.0×10-2mol/L盐酸代替A1中的邻苯三酚;A3:以样品溶液代替A1中的蒸馏水;A4:以1.0×10-2mol/L盐酸代替A3中的邻苯三酚。

1.3.5 DPPH自由基清除能力测定［9］

取0.2 mL原溶剂加入7.8 mL浓度为2.5×10-3mg/mL DPPH·甲醇溶液，立即混匀，避光室温放置30 min，以原溶剂调零，于实验扫描确定的最大吸收波长处测定其吸光度，得A0值;以不同浓度的样品溶液代替A0中的0.2 mL原溶剂，测吸光度得Ai值;以原溶剂代替Ai中的7.8 mL DPPH·溶液，测吸光度得Aj值。每个处理均做三个重复，并以同浓度L-抗坏血酸作阳性对照。按下式计算(DPPH·)的清除率:

图1 标准脂肪酸衍生物(A)及油菜蜂花粉超临界提取物(B)的色谱分离图Fig.1 HPLC-FLD chromatograms of standard fatty acid derivatives(A)and fatty acid derivatives of rape bee pollen supercritical fluid extract(B)

1.3.6 羟基自由基清除能力测定［10］

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法。取7.5×10-4mol/L邻二氮菲溶液1 mL于试管中，依次加入0.2×10-3mol/mL(pH=7.4)的磷酸盐缓冲液2 mL和蒸馏水1 mL，充分混匀后，加入7.5×10-4mol/L硫酸亚铁溶液1 mL，混匀再加1 mL 0.01%H2O2后在37℃下水浴反应60 min，于实验扫描确定的最大吸收波长处测定其吸光度，得AP值;将上述方法中的H2O2用1 mL蒸馏水代替，测吸光度得Ab值;用样品溶液代替1 mL蒸馏水，测吸光度得AS值。同时分别对每个样品做本底组，每个处理均做三个重复，并以同质量浓度的L-抗坏血酸作为阳性对照。对·OH的清除率按如下公式计算:

2 结果与分析

2.1 标准品的HPLC-FLD色谱分离

如图1(A)所示，39种标准脂肪酸衍生物获得良好的基线分离。其中，本实验在流动相D中添加了溶解能力极强的DMF，可以使难以洗脱的高碳长链脂肪酸实现快速洗脱，避免过长的分离时间。

2.2 PSFE样品HPLC-FLD分析及含量测定

按上述实验条件，对脂肪酸标准品衍生后进行了HPLC-FLD分析测定，依据峰面积和实际进样量进行线性回归，得到各标准脂肪酸衍生物的回归方程、相关系数和检出限，见下表1。各种脂肪酸的检测限为6.05～98.86 fmol，各种脂肪酸的线性相关系数均大于0.9989。以相同的实验条件，对PSFE提取物衍生后进行了HPLC-FLD分析测定，色谱分离图见图1(B)，样品中各类脂肪酸的种类及含量见表1。结果表明，PSFE提取物中含有丰富的游离脂肪酸，其中饱和脂肪酸占总游离脂肪酸的58%，不饱和脂肪酸占总游离脂肪酸的42%。PSFE提取物中含量较高的不饱和脂肪酸种类主要是C18∶3、C18∶2和 C18∶1，其中 C18∶3的含量最高，达到了10933.69 μg/g。PSFE提取物中含量较高的饱和脂肪酸为C16，含量达到了4116.436 μg/g。

表1 线性方程、相关系数、检测限及PSFE样品中脂肪酸的含量Table 1 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and fatty acids contents of PSFE

a:回归方程Y=AX+B，Y:峰面积;X:进样量(pmol)。a:In the regression equation Y=AX+B，Y refers to the peak area，X refers to the injection amount(pmol).

2.3 PSFE样品对超氧阴离子自由基的清除作用

实验首先对邻苯三酚自氧化中间产物的吸收波长进行了扫描测定。由图2可知，邻苯三酚自氧化中间产物在波长268 nm和299 nm两处分别有特征吸收峰，当加入实验浓度范围内的L-抗坏血酸后，在299 nm处的吸收峰明显降低，而268 nm处的吸收峰基本不变，因此，本实验确定该超氧阴离子自由基体系的检测波长为299 nm。

图2 邻苯三酚自氧化产物最大紫外吸收光谱及L-抗坏血酸清除的光谱Fig.2 UV absorption spectra of pyrogallol autoxidation product and L-ascorbic on scavenging

图3 PSFE及L-抗坏血酸对的清除作用Fig.3 The scavenging effects of PSFE and L-ascorbic acid on

2.4 PSFE样品对DPPH自由基的清除作用

由图4可知，经扫描测定发现DPPH·甲醇溶液在320 nm和515 nm处分别有两个特征吸收峰，当加入实验浓度范围内的L-抗坏血酸溶液后，其位于515 nm处的吸收峰明显降低，因此，本实验确定用515 nm作为测定DPPH·含量变化的检测波长。

图4 DPPH·的吸收光谱和L-抗坏血酸清除DPPH·的吸收光谱Fig.4 UV absorption spectra of DPPH·and L-ascorbic on scavenging DPPH·

由图5可知，在实验浓度2.0～10.0 mg/mL的范围内，阳性对照物L-抗坏血酸对DPPH·的清除率变化不大，保持在50%上下。而PSFE样品对DPPH·的清除作用随着其样品浓度的增大而逐渐升高，达到60%以上，高于阳性对照。

图6 邻二氮菲-Fe2+的吸收光谱和 L-抗坏血酸清除·OH的吸收光谱Fig.6 UV absorption spectra of 1，10-Phenanthroline monohydrate-Fe2+and L-ascorbic on scavenging·OH

2.5 PSFE样品对羟基自由基的清除作用

由图6可见，经实验扫描发现邻二氮菲-Fe2+反应液在510 nm处有最大吸收峰，当加入实验浓度范围内的阳性对照物L-抗坏血酸后，由于抑制了双氧水与邻二氮菲-Fe2+发生反应产生·OH，因而在一定程度上使得邻二氮菲-Fe2+反应液产生的最大吸收峰降低或甚至消失，因此，本实验确定以510 nm作为各反应液的检测波长。

PSFE样品及L-抗坏血酸对·OH的清除效果由图7可知，在实验浓度0.2～1.0 mg/mL的范围内，PSFE对·OH有一定清除效果，且其清除能力随着样品浓度的逐渐增加而略有增大。但与L-抗坏血酸相比，其清除效果不强。据有关研究报道，·OH是所有氧自由基中最活泼的，许多自由基清除剂即使能够清除，但是却不能清除·OH。这个结论在一定程度上有可能解释PSFE对·OH的清除效果不显著的原因。

图7 PSFE及L-抗坏血酸对羟自由基的清除作用Fig.7 The scavenging effects of PSFE and L-ascorbic acid on·OH

3 讨论

本实验利用 1，2-苯并-3，4-二氢咔唑-9-乙基对甲苯磺酸酯作为柱前荧光衍生试剂，通过HPLCFLD法对青藏高原油菜蜂花粉超临界提取物中的主要成分游离脂肪酸进行了定性和定量分析。结果表明，各种脂肪酸标准品的检测限为6.05～98.86 fmol，线性相关系数均大于0.9989。PSFE提取物中含有丰富的游离脂肪酸，其中饱和脂肪酸占总游离脂肪酸的58%，不饱和脂肪酸占总游离脂肪酸的42%。PSFE提取物中含量较高的不饱和脂肪酸种类主要是 C18∶3、C18∶2 和 C18∶1，其中 C18∶3 的含量最高，达到了 10933.69 μg/g。

同时，本实验对PSFE的体外清除自由基效果考察结果表明:该超临界提取物PSFE对DPPH自由基表现出很高的清除能力且呈量效关系，即在实验浓度范围内其清除率最高可达60.29%，高于阳性对照物;而对于羟基自由基和超氧阴离子自由基，该超临界提取物也表现出不同程度的清除能力，即在实验浓度范围内其最高清除率分别为7.59%和11.99%。据报道，新鲜的蜂花粉抗氧化活性最高，其后随着贮存年头的增加其抗氧化能力减小，经过3年以上贮存后其抗氧化活性会减少50%。本实验所用材料为自然贮存两年的油菜蜂花粉，其超临界提取物的自由基清除能力是否比当年采收的蜂花粉有所降低，还有待进一步研究。

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