子宫内膜异位症中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化研究

单莉莉，朱婷，王中海

广东医学院 附属南山医院，广东 深圳 518052

子宫内膜异位症简称内异症，是妇科常见疾病，常导致痛经、不孕等症状，严重影响女性身心健康。错配修复基因1（human mutL homolog 1，hMLH1）与错配修复基因2（human mutS homolog 2，hMSH2）是人类细胞内错配修复系统（mismatch repair system，MMR）的重要组成基因，它们担负对错配位点的识别和切除的主要功能。我们应用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific PCR，MSP），检测了卵巢子宫内膜异位症组织和正常子宫内膜中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化情况，并分析了其与内异症的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

我院收治的卵巢子宫内膜异位症患者23例，所有患者术前未经激素治疗，采集异位内膜组织；20例在我院行节育术、子宫脱垂手术的患者，所有患者均排除了患有其他器官系统恶性肿瘤的可能，留取正常子宫内膜组织。所有标本无菌采集后立即置-80℃恒温冰箱中待用。

1.2 DNA提取

用小量组织基因组DNA抽提试剂盒（购自上海生工公司）提取组织DNA，紫外分光光度计定量，提取的DNA置-20℃保存。

1.3 hMLH1、hMSH2基因启动子甲基化的检测

MSP是近年发展起来的一种特异、灵敏的检测基因甲基化的技术。其原理是，利用亚硫酸盐可使DNA中胞嘧啶（C）脱氨而转变为尿嘧啶（U）的特性，将DNA用亚硫酸盐处理，未甲基化的胞嘧啶就转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。

取 1 μg DNA，用 CpGenome DNA Modifica⁃tion Kit（购自CHEMICON公司）进行甲基化修饰，然后以此为模板，分别用hMLH1甲基化引物与非甲基化引物（hMLH1-M、hMLH1-U）和hMSH2甲基化引物与非甲基化引物（hMSH2-M、hMSH2-U）进行PCR扩增（引物由上海生工公司合成，序列见表1）。50 μL PCR反应体系（BBI公司提供）包括2×PCR Mas⁃ter混合液 25 μL（含 3.0 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、0.1 U/μL Taq DNA 聚合酶）、hMLH1-M 或hMSH2-M 1 μL、hMLH1-U 或 hMSH2-U 1 μL、DNA模板（DNA浓度为 0.1～1 μg/μL）1 μL、去离子水1 μL。

hMLH1反应条件：95℃预变性5 min，以95℃变性 45 s、60℃退火 30 s、72℃延伸 30 s循环 35次，72℃延伸5 min。hMSH2反应条件：95℃预变性5min，以95℃变性40 s、55℃退火40 s、72℃延伸40 s循环35次，72℃延伸7 min。

表1 引物及序列

扩增产物经1.7%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外凝胶成像系统下观察。

1.4 统计学处理

采用SPSS12.0软件对结果进行统计学分析。

2 结果

用甲基化和未甲基化引物可同时扩增出产物者为部分甲基化，只有甲基化引物扩增出产物者为完全甲基化。

2.1 hMLH1基因的MSP结果

20例正常子宫内膜组织中出现了1例部分甲基化，异常甲基化率为5%（1/20）；23例子宫内膜异位症组织中出现了4例部分甲基化和5例完全甲基化，异常甲基化率为39%（9/23）。两者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、2。

2.2 hMSH2基因的MSP结果

20例正常子宫内膜组织中出现了1例部分甲基化，异常甲基化率为5%（1/20）；23例子宫内膜异位症组织中出现了2例部分甲基化，异常甲基化率为8%（2/23）。两者比较，无明显差异（P＞0.05）。见图3、4。

3 讨论

图1 子宫内膜异位症hMLH1基因启动子区甲基化情况

图2 正常子宫内膜hMLH1基因启动子区甲基化情况

图3 子宫内膜异位症hMSH2基因启动子区甲基化情况

图4 正常子宫内膜hMSH2基因启动子区甲基化情况

子宫内膜异位症异位内膜的来源至今尚未阐明，目前阐述发病机制的主要学说包括经血逆流学说、静脉淋巴播散学说、体腔上皮化生学说、诱导学说、干细胞起源学说、在位内膜决定论等。近年研究认为，内异症与糖尿病、高血压等疾病一样，是多基因多因素共同作用的结果，具有复杂的遗传特征，也是一种表观遗传疾病[1]。

DNA错配修复系统（MMR系统）是细胞内在核苷酸水平上纠正复制错误的重要手段，可以通过校正新合成DNA链中错配的碱基而高效提高正常体细胞抵御突变的能力，常出现在细胞增殖过程中，对保持DNA复制的忠实性和基因组的稳定性起到关键作用[2]。MMR基因的改变使得细胞在增殖过程中的错误掺入与缺失不能修复，表现为整个基因组不稳定，随机突变率增高，使一系列靶基因如涉及细胞生长、分化、凋亡及肿瘤转移等的相关基因改变，从而导致肿瘤的发生、发展。DNA甲基化指在DNA甲基化转移酶（DNMT）的催化下，S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基基团被转移到胞苷嘧啶环的第5位碳原子上，形成甲基化胞嘧啶，哺乳动物中甲基化修饰主要发生在G/C含量丰富的CpG岛区域。CpG岛被甲基化并结合甲基CpG结合蛋白（MeCP），使基因关闭而抑制基因转录。DNA甲基化与基因表达呈反比关系，甲基化程度增高，则基因表达降低。研究发现，在MMR基因中，以hMLH1和hMSH2的功能最为重要，它们担负对错配位点的识别和切除的主要功能。hMLH1位于染色体3p21.3-23，基因组全长58 kb，含2268 bp的开放读框，有19个外显子，编码756个氨基酸残基。hMSH2定位于染色体2p22-21或2p16-15，基因组全长73 kb，含2727 bp的开放读框，有16个外显子，编码909个氨基酸残基。

近年，在多种人类恶性肿瘤的研究中发现了hMLH1启动子区域的异常甲基化[3-5]。子宫内膜异位症虽是良性疾病，但却具有类似肿瘤的复发和远处侵犯的特点。有学者利用激光捕获显微切割技术和RT-PCR检测子宫内膜异位症的异位内膜、在位内膜及正常子宫内膜中3种甲基化转移酶的基因表达，结果发现3种甲基化转移酶基因均过度表达，说明在子宫内膜异位症中确实存在DNA的异常甲基化[6]。在本研究中，我们采用MSP法同时检测子宫内膜异位症组织与正常子宫内膜组织中hMLH1、hMSH2启动子区的甲基化情况，进行比较性研究，结果显示，子宫内膜异位症组织中hMLH1启动子区甲基化发生率高于正常子宫内膜组织，差异具有统计学意义；在正常内膜与子宫内膜异位病灶之间，hMSH2启动子区甲基化情况没有显著区别。本研究结果提示，hMLH1启动子区异常甲基化可能是子宫内膜异位症的病因之一，而hMSH2启动子区甲基化与子宫内膜异位症之间不存在显著联系。

国外已有学者报道，异常甲基化的基因可作为一种新的癌症的生物学标志物[7]。Vaissière等[8]报道，定量分析特异性基因的甲基化情况并结合性别可作为识别肺癌的危险因素。Malekzadeh等[9]报道，Rb1和Casp-8启动子的甲基化状态可作为膀胱癌的一个预后指标。本研究在DNA水平显示，与正常子宫内膜相比，子宫内膜异位症组织存在着hMLH1启动子区的异常甲基化。那么，在未来，我们能否将hMLH1启动子区的异常甲基化检测作为内异症诊断的指标之一？能否通过检测hMLH1启动子区的甲基化情况来预测内异症的复发？本次实验只是对子宫内膜异位症中hMLH1、hMSH2启动子区甲基化的初步研究，我们尚需要大样本的实验来进一步证明上述论断，需要检测更多的错配修复基因来寻找其与内异症的关系。

[1]乐杰.妇产科学[M].北京:人民卫生出版社,2008:325-330.

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[8]Vaissière T,Hung R J,Zaridze D,et al.Quantitative analy⁃sis of DNA methylation profiles in lung cancer identifies aber⁃rant DNA methylation of specific genes and its association with gender and cancer risk factors[J].Cancer Res,2009,69(1):243-252.

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