小鼠外周血免疫相关细胞的近日节律性研究

王庆敏，时粉周，唐 瑛，刘秋红，戴圣龙，李科华

近日节律又名昼夜节律，是一种周期约为24 h的节律，是随着白天和黑夜的交替而发生变化,在生命活动中起着重要的作用[1- 4]。机体的多种生理活动都被该种节律调控，如睡眠与觉醒、血压、体温、心跳及激素水平等。相关研究提示哺乳动物的免疫系统也存在近日节律现象,免疫系统近日节律紊乱可以导致多种疾病的发生[5]。因此,免疫系统是否存在近日节律性变化已日益引起人们的重视。已有相关实验表明，免疫细胞系统的重要成分——单核细胞(来源于骨髓单系祖细胞)存在近日节律[6]。国内外虽然有小鼠相关免疫功能的近日节律研究报道,但其方法多为镜下计数,主观性较强,且报道的免疫细胞种类较单一，特别是一些淋巴细胞亚型的近日节律性目前尚不清楚。

本研究以C57 BL/6小鼠为研究对象，在12 h明∶12 h暗(12 h L∶12 h D)的光暗循环条件下,对其外周血中多种免疫细胞的昼夜波动性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 动物及模型建立 雄性C57 BL/6小鼠36只(体质量16～20 g)，4～6周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司，按数字表法随机分为6组，每组6只。然后置于恒温(22 ℃)、恒湿及12 h L∶12 h D(8∶00-20∶00光照,20∶00-8∶00黑暗)的光暗循环条件下适应性饲养4周，饲养期间小鼠自由摄食、饮水。光照期，鼠笼中央光强度为250 lx左右，黑暗期操作时红光强度为10～15 lx。

1.2 试剂与材料 流式Anti-Mouse CD4 APC、Anti-Mouse CD8 PE为eBioscience公司产品，红细胞裂解液为BD公司产品。小鼠外周血液成分用法国Hemastar 3全自动血液分析仪分析。

1.3 免疫细胞的检测方法 小鼠在上述光照循环条件下饲养4周后，在9∶00、15∶00、21∶00、3∶00 4个时间点眼球取血，经Na2-EDTA抗凝处理后(1∶1),测定血液中各种免疫细胞数。测定的指标包括白细胞(WBC)、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞总数、CD4+淋巴细胞及CD8+淋巴细胞百分比。

1.4 流式分析CD4+、CD8+淋巴细胞百分比 小鼠外周血经Na2-EDTA抗凝处理后(1∶1)，经破红处理,加入2 ml PBS洗涤、离心，沉淀用流式缓冲液重悬细胞。按说明书要求加入CD4+、CD8+荧光抗体，4 ℃避光孵育15 min,然后用2 ml流式缓冲液洗涤1次，上机检测。

1.5 统计学处理 测定结果采用均数±标准差(x±s)表示，采用Student′st检验比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血WBC总数的近日节律性 见图1。在1昼夜24 h里，WBC总数在15∶00最高,在21∶00最低，分别为(9.1±1.8)×109/L和(3.8±0.7)×109/L。峰值与谷值相比差异有统计学意义(P<0.01)。

注：与21∶00时比较aP<0.01

2.2 外周血淋巴细胞及其亚型(CD4+、CD8+)的近日节律性 如图1所示,淋巴细胞总数15∶00达到高峰，为(8.57±1.21)×109/L；21∶00达到谷值，为(3.45±0.42)×109/L；峰值和谷值差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞技术检测结果显示,CD4+淋巴细胞的百分比21∶00时最高，15∶00时最低，峰值与谷值差异有统计学意义(P<0.01)；CD8+淋巴细胞的百分比21∶00时最高，9∶00时最低。峰值与谷值差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：与15∶00时比较aP<0.01；与9∶00时比较bP<0.05

2.3 外周血中性粒细胞的近日节律性 在1昼夜24 h里，中性粒细胞数在3∶00达到峰值，为(0.127±0.009)×109/L；在9∶00达到谷值，为(0.081±0.007)×109/L。峰值和谷值差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

2.4 外周血单核细胞的近日节律性 在1昼夜24 h时间里，单核细胞数在15∶00达到峰值，为(0.487±0.031)×109/L；在21∶00达到谷值，为(0.247±0.017)×109/。峰值和谷值差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

注：与21∶00时比较aP<0.01；与9∶00时比较bP<0.05

3 讨论

近日节律与机体的多种生理功能的变化关系密切,近日节律的破坏(如海上航行的倒班、值更)会导致人体产生多种不适、警觉性降低、情绪改变(如激越)、机体功能紊乱及疾病的发生。相关研究表明，近日节律的改变将增加患高血压、心脏病、糖尿病及代谢性疾病、睡眠障碍和免疫功能紊乱的发生[7-8]。

船员长航、飞行员在特殊时间执行任务均可导致免疫功能近日节律的紊乱。长期轮换班、夜间工作以及长期工作于跨时区飞行航班上的女性乘务员因近日节律经常被打乱，乳腺癌的发病率较之对照组增高约48%[7]。流行病学资料提示[8]，夜间光照以及光照环境导致的昼夜节律紊乱会增加结肠癌的发生机会。目前已证实，免疫系统近日节律失调与肿瘤有关。在肝癌大鼠中发现,不但其免疫系统在构成上发生变化,免疫系统原有的近日节律也遭到破坏[9]。HIV感染患者T、B淋巴细胞的近日节律性逐渐丧失。另外，机体对传染性疾病的易感性、疾病的发展进程(如风湿性关节炎、哮喘)等也存在近日节律性。这些都提示免疫系统近日节律的改变是这些疾病发生、发展的关键因素之一。有效防治这些与免疫功能近日节律紊乱相关的疾病的前提是要明晰正常状态下各免疫细胞的近日节律性。

笔者系统研究了在12 h L∶12 h D光暗循环条件下小鼠外周血中各免疫细胞的近日节律性。先前也有相关文献报道了小鼠外周血内免疫细胞的昼夜变化规律，但只选择了几个指标进行研究[10-11]，国内关于免疫细胞及功能的近日节律性研究较少，相关研究也不够系统。本研究表明C57 BL/6小鼠外周血白细胞的趋势与国外相关报道一致[12]。本研究进一步检测了C57 BL/6小鼠外周血中的其他免疫成分,结果表明正常小鼠的外周血WBC计数、淋巴细胞百分比、单核细胞数、中性粒细胞数均存在着昼夜节律性。各类淋巴细胞的峰值均在15∶00-21∶00之间，单核细胞的百分比在15∶00达到高峰，中性粒细胞在3∶00达到高峰，说明小鼠外周血中各免疫细胞的峰值和谷值不在同一时间段,存在此消彼长的现象。这种方式可能有利于小鼠在不同时间段维持一定的免疫力。

综上所述，本研究较系统地研究了C57BL/6小鼠外周血中各免疫细胞的近日节律性变化，不仅为深入理解免疫系统的机制提供依据，也为实验动物学及免疫功能近日节律紊乱相关疾病的临床治疗打下基础，为深入理解军事人员(如长航舰员及跨时区飞行的飞行员)由于工作岗位的需要导致的免疫系统近日节紊乱提供理论依据。

[参考文献]

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[12] Kolaczkowska E, Chadzinska M, Seljelid R, et al.Strain and laboratory routines:studies of male C57BL/6J,Balb/c and CB6 F1 mice[J].Laborat Anim, 2001,35(1):91-100.