猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法的建立及应用

张 影，贾立军，薛书江，钱年超，张守发

（延边大学农学院动物医学系，吉林 延吉133002）

附红细胞体病是由附红细胞体（Mycoplasma）寄生于多种动物和人红细胞表面及血浆、骨髓内而引起的一种人兽共患病。目前，针对附红细胞体病的诊断已建立了多种检测技术，补体结合试验、荧光抗体试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验等血清学技术已用于检测附红细胞体抗体［1－3］。但国内外比较公认的是检测到病原体的存在，常用的方法有姬姆萨染色镜检病原体和PCR检测核酸的方法，Gwaltneys等证实PCR方法是进行附红细胞体病诊断和研究的一种有价值的方法，而且具有较高的特异性和敏感性［4－6］。本试验选择了猪附红细胞体热休克蛋白DnaJ基因建立猪附红细胞体病PCR诊断方法，旨在为猪附红细胞体病的快速诊断建立准确、特异、敏感的检测技术。

1 材料与方法

1.1 血样来源 猪附红细胞体阳性血样由延边大学预防兽医学实验室鉴定并保存，53份待检猪血液样品采自吉林省延边地区。

1.2 试剂 血液基因组DNA提取试剂盒、dNTP、ExTaq酶、琼脂糖、DNA Marker 2 000等，均购自宝生物工程（大连）有限公司；其他试剂为进口或国产分析纯产品。

1.3 引物设计 根据GenBank上发表的猪附红细胞体（猪支原体 NC＿015153.1）全基因组序列中DnaJ基因序列，应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31软件设计了1对特异的引物D1和D2，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

引物序列为：上游D1：5′－ATCATCCCGACATTAACAA－3′；下游 D2：5′－CCCATTCCCTTTAGT－TTCA－3′。

1.4 附红细胞体DNA的提取 猪附红细胞体阳性血样基因组DNA按照全血基因组DNA提取试剂盒的操作说明书进行。

1.5 PCR扩增、退火温度的筛选 以提取的猪附红细胞体DNA为模板，进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度梯度为53℃～59℃45s，30个循环，最后72℃延伸5min。

1.6 PCR扩增产物的回收、鉴定与测序 将868 bp的PCR扩增产物片段按照DNA提取试剂盒说明对目的片段进行回收纯化，经琼脂糖凝胶电泳检测正确后，将回收的目的片段克隆连接到pMD18－T载体上，转化到大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中，在氨苄平板上筛选出阳性克隆，将阳性克隆菌送往上海英骏生物技术有限公司测序。

1.7 特异性试验 分别以犬新孢子虫、牛附红细胞体、犬附红细胞体、牛瑟氏泰勒虫的DNA为模板，按照最佳反应条件进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.8 敏感性试验 用紫外分光光度仪测定上述提取的猪附红细胞体DNA的OD260nm值，计算DNA含量。以10倍为梯度连续稀释成6个不同浓度，用最佳反应条件进行PCR扩增，以此来确定PCR方法的敏感性。

1.9 DnaJ基因PCR与姬姆萨染色镜检的比较 将采自吉林省延边地区的53份待检猪血液样品，进行DnaJ基因PCR检测，同时与姬姆萨染色镜检进行比较。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增 以猪附红细胞体DNA为模板，经PCR扩增出大小为868bp的基因片段，与预期结果相符（图1）。

2.2 最适退火温度的筛选 对猪附红细胞体DNA进行梯度PCR扩增，在56℃时条带最亮，将56℃定为最佳退火温度（图2）。

2.3 阳性质粒的测序结果 PCR产物测序结果如图3所示，下划线位置为引物位置，序列分析表明与GenBank中（NC＿015153.1）同源性为99%。

2.4 特异性试验 以猪附红细胞体、犬新孢子虫、牛附红细胞体、犬附红细胞体、牛瑟氏泰勒虫的DNA为模板，以D1、D2为引物，进行PCR扩增。结果显示，只有猪附红细胞体在868bp处扩增出了特异性条带，其他样品无特异性条带（图4），说明该方法具有较好的特异性。

2.5 敏感性试验 取PCR检测为猪附红细胞体病阳性血液DNA，按101～106进行倍比稀释，用D1、D2引物对不同稀释倍数的DNA依次进行PCR扩增。结果显示，样品经稀释后，经PCR扩增能检出106倍稀释的DNA，此时DNA的浓度值为124fg/μL。

2.6 DnaJ基因PCR与姬姆萨染色镜检的比较以53份猪血液样本DNA为模板，进行DnaJ基因PCR扩增，与姬姆萨染色镜检结果进行比较。结果显示，检测的53份血液样本，DnaJ基因PCR方法的猪附红细胞体阳性检出率为86.8%（46/53），姬姆萨染色镜检方法的猪附红细胞体的阳性检出率为15.1% （8/53），其中染色镜检为阳性的血液样本，PCR检测也均为阳性（表1）。

表1 DnaJ基因PCR扩增和姬姆萨染色镜检方法的比较

3 讨论

近年来，由于附红细胞体病具有广泛的流行性、高度的感染性，该病的感染动物数量和种类也呈上升趋势［7－8］。有关附红细胞体病的病原学、分子生物学诊断技术的研究已取得了一定进展，其中PCR方法具有快速、敏感、准确等特点，对猪附红细胞体病的检测具有高度的特异性和敏感性，对隐性感染猪群具有良好的检测效果。本试验经对53份现地血液样品的检测发现，PCR检测则为阳性率高于姬姆萨染色镜检阳性率，说明本试验建立的PCR检测方法比染色镜检方法更为敏感，能够检测到猪附红细胞体病的隐性感染，为提早的预防和治疗该病提供了重要的参考价值。

本试验基于猪附红细胞体DnaJ基因的序列，设计一对特异性引物，经PCR扩增出约868bp大小的基因片段，并进行PCR条件的优化，建立了猪附红细胞体DnaJ基因PCR检测技术。通过血涂片姬姆萨染色镜检和PCR方法对53份血样进行猪附红细胞体的检测比较，结果PCR检测方法的阳性检出率明显高于姬姆萨染色镜检，进一步证明了PCR检测方法的灵敏度高，更适合对猪附红细胞体的检测。

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