猪小肠与犬食管脱细胞基质（ECM）构建组织工程化人工食管的比较研究

李春霖，薛锦儒，崔建华

（吉林大学中日联谊医院 胸外科，吉林 长春130033）

食道癌是我国北方人群中的一种高发疾病，外科手术是治疗该病的首选方法。然而，手术所造成消化道结构的改变以及对消化生理的影响是不可逆转的，所以长久以来人们一直在寻找一种食管替代物以代替病变食管，人工食管的研究逐渐成为胸外科对食道病损治疗探索的主要课题。尽管用不同的材料和组织进行过许多人工食管的研究［1］，直到组织工程技术的兴起才为人工食管的发展开辟了广阔的前景。采用组织工程技术体外构建人工食管，是人工食管研究的一种新的方法，其中种子细胞的选择、支架材料的研制、种子细胞与支架材料的复合是整个研究的关键所在。

我们采用了犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）做为种子细胞，猪小肠脱细胞基质膜（IECM）作为载体支架，分别以犬自体食道脱细胞基质（EECM）和人工涤纶材料补片（ePTFE）作为对照，比较研究BMSCs在上述三种材料上的生长情况。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 本地白猪，体重35kg左右 ，雌雄不限；本地家犬，雄性，10月龄左右，体重约15 kg。实验过程中对动物处置均符合动物伦理学的要求。

1.1.2 主要试剂 狗骨髓间质干细胞完全培养基（美国cyagen公司），重组人碱性成纤维细胞生长因子（美国peprotech公司），胰蛋白酶（美国Sigma公司），CD29，CD34，CD44，CD45，CD90，CD105流式抗体（美国Beckman公司）等。

1.1.3 主要设备 扫描电子显微镜（日本Olympus公司），倒置相差显微镜（日本电子公司），流式细胞仪（美国Beckman公司）等。

1.2 方法与步骤

1.2.1 细胞外基质膜的制备及处理 取新鲜猪小肠若干，选自空肠部分。沿纵轴切开，特制装置下固定，以眼科剪在肌层剪出一系列稠密切口，切口深度不可超出肌层。用自制刮除器将肌层仔细刮除，然后将其翻转，以同样的方法将小肠的粘膜层刮除干净，所剩下白色菲薄，半透明的膜状物即为脱细胞基质膜（ECM），如图－1所示。在刮除过程中，应间断生理盐水冲洗，以保持其表面的湿润性。制备好的ECM标本再经进一步化学方法处理［2］，材料与溶液体积的比例均保持在1∶100。首先在100mmol／L的乙二胺四乙酸（EDTA）和10mmol／L氢氧化钠的溶液（ph值为11－12）中浸泡16h，用去离子水冲洗干净后浸泡于含1mmol／L盐酸和1mmol／L氯化钠的溶液（ph值为0－1）中6－8h，去离子水冲洗，置于含1mmol／L氯化钠的PBS溶液中16h，去离子水冲洗，PBS浸泡2h后再次用大量去离子水仔细冲洗，－80℃冻存，真空干燥机冷冻干燥后粒子加速器25kGy照射灭菌［3］。ECM标本做电镜扫描观察。

图1 脱细胞处理的猪小肠基质膜IECM

1.2.2 MSCs的体外分离、培养及扩增 取10月龄本地家犬一只，体重约为16.5kg，备皮，常规麻醉后固定于实验台，选好穿刺点，取一次性骨穿包，消毒铺巾。穿刺成功后取50ml注射器并预抽2ml肝素钠以抗凝，抽取骨髓血20ml左右后将穿刺点加压包扎。迅速于无菌操作台中，将骨髓血转入50 ml离心管，并加入20ml PBS，1 500rad／min，离心8min。弃上清，再次加入30ml PBS，再次离心弃上清后加入6ml培养基，吹打混匀，等量接种于两个培养皿中，置于37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中，隔天换液，待换液两次后即可于显微镜下观察到几簇梭形、贴壁生长的细胞群，为原代细胞，记为P0。当镜下观察几簇细胞密度过大时，吸出培养基，加入适量的0.25%胰酶后放于培养箱中消化细胞重新铺皿，消化完成后重新加入培养基，适量的FGF－basic，摇晃均匀后标记为P1，置于培养箱。隔天换液，待镜下观察细胞生长至90%融合时，再次消化，并以1∶3传代。重复如上操作，反复传代扩增以备使用。

1.2.3 MSCs生长曲线的绘制 分别取生长状态良好的1、3、5代的细胞，0.25%胰酶消化后，以1×104／孔的密度接种于6孔板中，单独培养，用于细胞计数。根据计数结果以细胞数量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制生长曲线。

1.2.4 MSCs流式细胞仪检测 取消化后的P2细胞，加入PBS，制成细胞悬液，PBS洗涤2次后，细胞悬液调整为密度106／ml，分装至7只试管中，6个分别 加 入 5 μl CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105抗体，避光染色30min，1个作为空白对照，PBS洗涤两次后重悬细胞，上机，开始流式细胞仪测试。

1.2.5 MSCs与支架材料的复合 分别取大小为2 cm×2cm的IECM，EECM，ePTFE，分别以EECM和ePTFE作为对照组，IECM作为实验组。粒子加速器灭菌处理后分为3组，每组20个，PBS浸泡24 h后置于6孔板中，将第二代MSCs以密度1×107／ml分别接种于其表面，3h后加入适量培养基，置于培养箱中，每48h更换培养液。15d后取出标本做石蜡切片，HE染色观察。

1.2.6 统计学处理 应用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 ECM扫描电镜观察结果 ECM经过脱细胞处理过的基质膜表现出良好的立体三维空间结构，具有均匀的空隙率和孔径，三维孔隙间呈梭状结构，并且之间相互连通。细胞层已经完全去除，没有细胞以及细胞碎片成分的残留；表面弹性蛋白网状结构完整、排列整齐，显示出规则的孔隙结构，而且单根的纤维结构没有明显的膨胀或碎裂。如图2所示，可见清晰的纤维网状结构。

图2 脱细胞基质膜电镜扫描

2.2 MSCs的形态学观察及增值情况 原代细胞消化重铺贴壁后可见皿底细胞均匀分布呈长梭形纤维细胞状，漂浮着少量为贴壁的细胞，换液即可除去。加入FGF－basic后贴壁细胞迅速增值分裂，6－7 d细胞已铺满瓶底，融合至95%，呈旋涡状排列整齐有序，杂质细胞已经明显少见，如图3。

图3 犬骨髓间充质干细胞P2培养存化过程2d，4d，6d，8d，（×100）

2.3 MSCs的生长曲线 第1、3、5代细胞培养1－2 d，细胞增值较慢，为潜伏期，此后，细胞生长分裂速度明显加快，呈指数形式增长，进入第8天生长速度减慢，进入平台期，如图4，此时细胞几乎铺满皿底。

图4 犬骨髓间充质干细胞第1、3、5代生长曲线

2.4 MSCs表面抗原检测 对P2细胞进行流式细胞仪检测，发现细胞强表达间充质干细胞抗原CD29、CD44、CD90、CD105［4］，表达率分别为 95.7%、98.4%、99.0%和100%，几乎不表达 CD34、CD45，如图5所示，说明实验中所分离提取培养的细胞是BMSCs。

2.5 细胞与材料复合结果 BMSCs与各组支架复合培养15d后观察。观察培养基成分，判断有无污染，各组结果分别为：EECM组标本污染3个，IECM组与ePTFE组标本各污染1个，污染原因考虑可能为操作中的失误。取无污染的标本做HE染色，可见BMSCs与IECM组、EECM 组、ePTFE组复合结果分别为17、15、8，复合率为85%、75%、40%，观察结果如图6所示。以IECM组作为实验组，EECM组作为对照组时，复合结果无显著性差异（P＞0.05）；ePTFE组作为对照组时，复合结果有显著性差异（P＜0.05），说明IECM 和EECM 与BMSCs复合效果相似，而ePTFE与BMSCs复合效果不如IECM。

图5 P2代犬骨髓间充质干细胞流式表面抗体鉴定

图6 A：复合培养后ECM上无BMSCs生长B：BMSCs与ECM接种后生长良好 （20×10）

3 讨论

骨髓间充质干细胞是骨髓基质内的非造血细胞来源的细胞亚群，为成体干细胞，可在体外经诱导分化为多种细胞类型［5－7］。具有取材方便，易分离培养，增殖能力强，机体几乎没有移植排斥反应的发生，即使发生，程度也比较轻微，易于处理［8］，是目前公认的组织工程最佳种子细胞。

具有细胞相容性是对组织工程支架材料最基本的要求。本文在总结以往研究的基础上，经过物理化学相结合的方法，制备出脱细胞基质膜。ECM有良好的组织相容性［9］，可为种子细胞提供迁移、附着、增殖的环境，还可与宿主结合，促进血管的再生［10］，植入体内后还可使周围组织相邻组织细胞沿支架移行和生长［11］，由于去除了细胞成分，此种来自异种动物的生物材料没有抗原性，在宿主体内不发生免疫排斥反应［12］，所以用ECM制备人工食管技术上是可行的［13］。

本实验研究为构建人工食管，将BMSCs与IECM接种后分别于EECM和ePTFE做对比研究，发现BMSCs均可与彻底灭菌的3种材料实现复合，但在接种成功率方面天然生物材料ECM要明显高于人工材料ePTFE，与此同时虽然部分ePTFE也能够与种子细胞复合培养成功，但完全不具备收缩功能，体内组织再生后其不能被降解吸收，将作为异物长时间存在。接种BMSCs培养后的IECM与EECM生物学性状相似，能够实现功能和生理的再生［14］，因此优于人工材料ePTFE，而且IECM来源广泛，成本低廉，人工操作性极大，所以以BMSCs为种子细胞与IECM支架复合构建组织工程化的人工食管，从理论上可以真正实现生理意义上的食管再生。

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