FRAT1基因真核表达质粒的构建与鉴定

于庆功，张欣欣，谷 伟，王苏雅，杨子荣

（大连大学附属中山医院 消化内科，辽宁 大连116001）

原癌基因FRAT1（frequently rearranged in advanced T－cell lymphomas 1）最初发现于鉴定转基因小鼠体内促进淋巴瘤生成的基因［1］，后研究发现FRAT1为肿瘤发生相关 Wnt／β－catenin信号转导通路的正相关因子［2］。RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是指在生物体内源性或外源性双链RNA（double－stranded RNA，dsRNA）引起体内同源基因特异性的沉默。RNAi技术具有较高的选择性和特异性，因其仅抑制致病基因，对正常等位基因的功能不产生影响。本研究以siRNA介导FRAT1表达沉默，后续观察siRNA导入后对人结肠癌HR－29细胞内的FRAT1表达的抑制作用，为研究FRAT1对结肠癌增值凋亡侵袭的研究提供了稳定的转染细胞干扰质粒。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

大肠杆菌E.coli Competent Cell JM109、限制性内切酶BamHⅠ／ClaⅠ、Premix Taq（Code No.DRR003A）、引 物 pSINsi－F2／pSINs Ⅰ－RTotal、RNA提取试剂（RNAisoTM Plus）、高保真DNA聚合酶（PrimeSTARTM HS DNA Polymerase）、DNA marker、DNA连接试剂盒（DNA Ligation Kit）等均购自TaKaRa公司；载体质粒pSINsi－hU6、质粒小量抽提试剂盒（Plasmid Mini KitⅠ）和纯化试剂盒（E.Z.N.ATMCycle－Pure Kit）购自OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 FRAT1基因siRNA的设计与合成根据GeneBank中FRAT1（NC＿000010.10）基因序列，采用RNAdraw分析软件对FRAT1mRNA序列的二级结构进行预测，并利用Elbashir等推荐的siRNA设计原则，寻找合适的siRNA靶序列。选择在FRAT1基因的864位选取干扰序列。最后得到CTF181－1 核苷酸序列 CAGTTACGTGCAAAGCTT和阴性对照CTF181－N核苷酸序列TCTTAATCGCGTATAAGGC。根据Genbank中FRAT 1（NC＿000010.10）基因序列，分别设计引物，CTF181－1 上游引物序列为：5′GATCCAGCAGTTACGTGCAAAGCTTCTGTGAAGCCACAGATGGGAAGCTTTGCACGTAACTGC TTTTTTTAT3′，下游引物序列 为：5′CGATAAAAAAAGCAGTTACGTGCAAAGCTTCCCATCTGTGGCTTCACAGAAGCTTTGCACGTA－ACTGCTG3′；CTF181－N 上游引物序列 为：5′GATCCATCTTAATCGCGTATAAGGCCTGTGAAGCCACAGATGGGGCCTTATACGCGATTAAGATTTTTTTAT3′，下游引物序列 为：5′CGATAAAAAAATCTTAATCGCGTATAAGGCCCCATCTGTGGCTTCACAGGCCTTATACGCGATTAAGATG3′（斜体部分分别为BamHI、Cla I的酶切位点）。

1.2.2 FRAT1基因siRNA质粒的构建 首先将合成的原始引物CTF181－1，CTF181－N稀释成0.010D／μl。使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice TP600进行退火反应体系10μl：sense oligo 1 μl、anyisense oligo 1 μl、STE Buffer（10mMTris pH8.0，50mM NaCl，1mM EDTA 配制）1μl、H2O 7μl于94℃退火5min，缓慢降至30℃冷却90min。阳性和阴性对照的上下游引物自身分别合成含有折环的双链DNA。产物放于4℃冰箱保存。使用TaKaRa DNA Ligation Kit（Code No.D6022）中的Solution I将退火产物分别与pSINsi－hU6（BamH I／Cla I）载体连接后，热转化至E.coliCompetent Cell JM109（Code No.D9052）中，分别命名为 CTF181－1、CTF181－N，涂布平板后，37℃过夜培养。

1.2.3 FRAT1基因siRNA质粒的鉴定：从转化平板上挑取8个单菌落，用Premix Taq（Code No.DRR003A）和引物pSINsi－F2／pSINsi－R进行PCR扩 增，引物序列分别为：pSINsi－F2：CAAGGTCGGGCAGGAAGAGG；pSINsi－R ：CTTTCCACACCTGGTTGCTG，检测阳性克隆，将反应产物做1%琼脂糖凝胶电泳。挑取阳性菌落植菌，提取质粒分别命名为 CTF181－1－1、CTF181－N－1，此两种质粒与空质粒分别穿刺菌保200ng，和未菌保小量克隆质粒加小量原质粒，共分6组，分别为：①CTF182（CTF181－1－1）（200ng）；②CTF181－1－1小量质 粒；③CTF182（CTF181－N－1）（200ng）；④CTF181－N－1小量质粒；⑤CTF182（pSINsi－hu6）（200ng）；⑥pSINsi－hu6原质粒，再次进行 PCR扩增检测目的基因表达。质粒测序：以质粒抽提试剂盒小量提取扩增后的重组质粒提交大连宝生物公司使用 pSINsi－F2引物对 CTF181－1－1、CTF181－N－1质粒进行测序。

2 结果

2.1 阳性克隆筛选结果 两干扰序列各挑取8个阳性克隆菌落PCR扩增抽提质粒，1%琼脂糖凝胶电泳照片如（图1），阳性克隆片段分子量应为317 bp，结果显示CTF－1－1的8个阳性克隆目的基因长度与理论长度相符，表明序列插入质粒。

图1 两序列8组阳性克隆菌落PCR凝胶电泳图片

2.2 PCR扩增检测阳性菌落结果

提取纯化的质粒分6组，结果用1%琼脂糖凝胶电泳检测（图2），目的基因片段长度符合理论长度，重组质粒pSINsi－hU6－siRNA构建成功。

2.3 测序结果 DNA测序结果证实插入正确，检测序列与预期序列一致（图3）。

3 讨论

Wnt／β－catenin经典信号转导通路（canonical Wnt／β－cantenin pathway）是 Wnt信号通路中的一支。该通路通过β－catenin的核易位，激活靶基因的转录活性［3，4］，在胚胎发育和肿瘤发生发展中具有重要作用。大量研究发现它异常的启动或时间空间表达都将导致细胞恶变肿瘤发生［5］，并且此通路与细胞凋亡存在广泛联系。FRAT1是FRAT家族的分子之一为Wnt／β－catenin信号转导通路的正相关因子。此基因位于人10号染色体长臂（10q24.1），分子量29KD，共包含279个氨基酸。其在与糖原合成酶激酶－3β（GSK－3β）结合之后抑制β－catenin的磷酸化，使胞浆内游离的β－catenin升高，然后胞浆内积聚的多量β－catenin进入胞核与 TCF／LEF家族结合并激活靶基因转录［6］。研究发现，FRAT1在多种肿瘤中都出现高表达［7－9］。但未见结肠癌相关报道。

图2 提取纯化的6组质粒目的基因PCR凝胶电泳图片

图3 pSINsi－hu6siRNA 测序图

研究FRAT1对结肠癌细胞的影响，首先沉默掉这一基因而后才能观察癌细胞的变化，这就需要RNAi技术的帮助。研究发现，针对同一个靶基因的不同siRNA序列其沉默效率也有差异［10］，为了更有效地沉默靶基因，设计出与靶基因高度同源且不与其他基因同源的siRNA序列是RNA干扰特异性的关键［11］，也是本实验的关键步骤。

本实验诣在针对FRAT1基因的不同位点设计合成siRNA序列的小干扰片段，结果显示载体中有完整的shRNA 序列，得到重组质粒pSINsi－hU6－siRNA9（CTF181－1－1）及阴性对照组 CFT181－N－1，证实FRAT1的RNAi载体成功构建，为进一步转染至结肠癌细胞沉默FRAT1基因，研究这一基因对癌细胞增殖凋亡侵袭的影响奠定了基础。我们将继续此方面研究。

［1］Freemantle S J，Portland H B，Ewings K，et al.Characterization and tissue－specificexpression of human GSK－3－binding proteins FRAT1and FRAT2［J］.Gene，2002，291（1－2）：17.

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［3］Moon R T，Bowerman B，Boutros M，et al.The promise and perils of Wnt signaling through beta－catenin［J］.Science，2002，296（5573）：1644.

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