Smads mRNA在神经元样细胞氧糖剥夺中的表达变化

王姣琦，何金婷，李宗树，胥桂华，莽 靖，徐忠信

（吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033）

研究发现激活素A（ActivinA，ActA）在缺血性脑损伤中发挥着积极的神经保护作用［1，2］。其介导的ActA／Smads信号转导通路，主要通过Smads级联反应将胞外信号传递入胞内［3］。根据Smads蛋白在信号转导中的不同作用，可将其分为3类：膜受体激活的Smads（receptor－activated Smads，RSmads），包括Smad1，2，3，5和8；通用Smad（common mediator Smads，Co－Smad），目前发现的仅有Smad 4；抑制性 Smads （inhibitory Smads，ISmads），包括Smad6、7［4］。本研究通过微管相关蛋白（Microtubule－associated protein 2，MAP2）染色验证鼠神经生长因子（NGF，50ng／ml）诱导分化的PC12细胞的神经元特性［5］。继而构建神经元样细胞氧糖剥夺模型（oxygen－glucose deprivation，OGD），体外模拟脑神经细胞缺血性损伤［6］。利用Real Time RT－PCR技术对OGD0，3，6h，Smad2、4、7基因mRNA的表达进行检测，为进一步明确ActA／Smads通路的神经保护机制提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞购自北京金紫晶生物医药技术有限公司。鼠神经生长因子（NGF）购自Sigma公司。兔抗大鼠 MAP2一抗、FITC标记的羊抗兔IgG抗体购自博奥森生物技术有限公司。Smad2、4、7及内参GAPDH基因引物委托上海生工公司合成。UNIQ－10柱式Trizol总RNA提取试剂盒购自生工生物工程技术服务有限公司，Quantscript cDNA第一链合成试剂盒、Real Master Mix（SYBR Green）试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PC12细胞培养 PC12细胞常规培养于含10%马血清和10%胎牛血清的高糖DMEM培养液。培养液2－3天更换一次，细胞接近80%融合时用0.25%胰酶进行消化传代。

1.2.2 PC12细胞转化神经元及鉴定 取对数生长期的PC12细胞以2.5－5×104·孔－1接种于预先放有细胞爬片的24孔细胞培养板，培养1－2天，细胞贴壁后加入NGF（终浓度50ng／ml），5天后取出细胞爬片，经0.01MPBS浸洗、0.1%TRiton X－100通透、羊血清封闭后加入 MAP2一抗（1∶500）4℃湿盒中过夜孵育，0.01MPBS浸洗后FITC标记的羊抗兔二抗37℃作用20min，防淬灭封片剂封片，共聚焦显微镜下观察。

1.2.3 神经元样细胞OGD模型的建立 取生长状态良好的神经元样PC12细胞，用无糖DMEM培养液冲洗3次，再用含10%胎牛血清和1.0mmol／L Na2S2O4的无糖DMEM培养液进行培养。培养瓶放入37℃孵箱内的缺氧罐中，计时0、3、6h分别建立OGD0，3和6h组。

1.2.4 Real Time RT－PCR检测Smads基因 mRNA的表达变化 收集上述3组细胞，Trizol法抽提总RNA，反转录制备cDNA。应用Real Time RT－PCR方法检测Smad2、4、7等基因 mRNA的表达，基因检测引物如下：Smad2F：5′－TCA GTG CGA TGC TCA AGC ATG TCC－3′，R：5′－AGA CCA AGC AGC AGC ACA CAC CTC－3′，扩增长度413bp；Smad7F：5′－TCC TGC TGT GCA AAG TGT TC－3′，R：5′－AGT AAG GAG GAG GGG GAG AC－3′，扩增长度104bp；Smad4F：5′－TCA CCG GCA GAT GCA GCA GC－3′，R：5′－GGC CCC AGC CCT TCA CGA AG－3′，扩增长度 203bp；GAPDH F：5′－GGT TAC CAG GGC TGC CTT CT－3′，R：5′－ATG GGT TTC CCG TTG ATG AC－3′，扩增长度171bp。反应体系为10μl，含上／下游引物（10nmol／L）各1μl，模板 DNA 2μl（约20 ng），ddH2O 1μl，Real Master Mix 5μl。应 用ABI7500Fast型实时荧光定量PCR仪进行PCR反应，ABI7500Fast程序软件进行荧光收集和资料分析。设定PCR运行参数为95℃预变性3min，然后95℃变性5s，60℃退火与延伸25s，共40个循环，并设定融解曲线程序。实验结果应用Relative Quantification（ddCt）Study进行相对表达量（relative quantity，RQ）RQ分析。以GAPDH基因为内对照，计算各基因在各组细胞之间的相对表达水平。检测实验均重复3次。

1.3 统计学分析

应用SPSS l0.0统计软件包，计量资料用±s描述，两个样本均数的比较采用独立样本t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析法，两组间比较用Students t－test，检验水准为双侧α＝0.05。

2 结果

2.1 MAP2免疫荧光染色

正常PC12细胞为圆形，易聚集成团，呈半悬浮状态。经NGF诱导分化后，细胞散在分布、呈星形并带有较长突起。MAP2染色后，蓝色激发光下胞体呈现绿色荧光；紫色激发光下可见呈蓝色荧光的复染细胞核。说明NGF诱导分化的PC12细胞MAP2强阳性表达。

2.2 Smad2mRNA的表达变化

OGD3h后Smad2基因mRNA的表达较OGD0h组升高17.7%；OGD6h，Smad2mRNA 的表达较OGD0h组下调80.9%，差别均有统计学意义（＊＊P＜0.05，图1－A）。说明氧糖剥夺可早期激活ActA／Smads通路在神经元样细胞内的转录表达。

2.3 Smad4mRNA的表达变化

OGD处理3h，神经元样细胞Smad4mRNA的表达与OGD0h组相比明显升高，超过413.4%；OGD6h组Smad4mRNA的表达与OGD3h相比下调73.0%，但与OGD0h相比，表达提高38.8%，差别均有统计学意义（＊＊P＜0.05，图1－B）。

2.4 Smad7mRNA的表达变化

经OGD处理3h后Smad7mRNA的表达水平与OGD0h相比明显升高，超过75.2%，差别有统计学意义（＊＊P＜0.05）。延长 OGD时间至6h，Smad7mRNA的表达较OGD0h组下降57.4%，差别有统计学意义（＊＊P＜0.05，图1－C）。

图1 Smad2，4，7基因mRNA表达的相对定量

3 讨论

最近的研究发现，转化生长因子β（Transforming growth factor－beta，TGF－β）超家族的重要成员ActA，在脑组织的缺血缺氧性损伤中发挥着积极的神经保护功能［7］。激活的ActA首先与TGF－βII型受体（TGF－βreceptor II，TβRII）结合，激活TβRII磷酸化激酶的同时形成受体复合物，TGF－βI型受体（TGF－βreceptor I，TβRI）结合该复合物，磷酸化激活后完成对Smad2／3的磷酸化活化，从而实现胞外信号的胞内转导［8］。作为ActA通路细胞内信号调节的主要蛋白，Smads根据其功能的不同又分为3类，即 R－Smads，Co－Smad和I－Smads。作为TGF－β或ActA的下游受体，Smad2／3通过与TβRI型受体作用而磷酸化激活。磷酸化的Smad2／3与Smads锚着蛋白（Smad anchor for receptor activation，SARA）分离并与Smad4形成 Smad2／4 和Smad3／4复合物，进而转入细胞核与DNA结合，通过与转录因子的相互作用完成对靶基因表达的调控［9］。I－Smads通过促进 TβRI受体降解，或与 RSmads竞争TβRI结合位点，抑制R－Smads磷酸化水平的方式来发挥其对该通路的负反馈调节作用。

本研究通过构建神经元样细胞氧糖剥夺模型，体外模拟神经细胞缺血性损伤。利用Real Time RT－PCR技术对OGD 0，3或6h，Smad2、4、7基因mRNA的表达变化进行检测。结果发现，OGD处理3h后神经元样细胞Smad2基因mRNA的表达与未处理组相比明显升高，分别超过17.7%。这进一步证明了氧糖剥夺模拟的神经细胞缺血性损伤中，ActA／Smads通路可以在OGD早期即通过提高通路上关键基因转录水平上的表达来激活。而延长OGD时间至6h，Smad2基因mRNA的表达较未处理组下调80.9%。说明 ActA／Smads通路应对OGD损伤时转录水平上的激活仅存在于OGD的早期，随着OGD时间延长，神经细胞缺血性损伤加重，ActA／Smads通路转录水平的表达也下调，甚至低于基础水平。Smad4mRNA的表达变化也证实了这一推测。OGD3h时，Smad4mRNA表达明显升高，与OGD0h相比上调413.4%。OGD6h时Smad4mRNA的表达水平较OGD3h组下调73.0%，与OGD0h相比，表达仍提高38.8%。这可能与OGD3h时Smad4mRNA表达过高有关。抑制性Smads，Smad7mRNA在OGD3h时的表达水平较 OGD0h升高75.2%；OGD6h时表达下降57.4%。说明ActA／Smads通路在转录水平上激活的同时，也存在着Smad7转录水平上负性调节功能的增强，两者动态调节完成对通路活化程度的调控。Hasan O.等人的研究也发现缺氧性损伤可提高血管内皮细胞内Smads基因转录水平上的表达［10］。说明Smads介导的神经保护机制不仅存在于神经元，而且还包括血管内皮细胞。

综上所述，ActA／Smads通路激活主要发生在神经元样细胞OGD损伤的早期（OGD3h），Smad2，4基因转录水平上的表达上调是该通路活化的重要组成部分。抑制性Smad7转录水平上参与该通路的负性调节过程。上述研究提示我们对ActA／Smads通路神经保护机制的研究，可能为神经细胞缺血性损伤后的神经保护提供新思路。

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