酿酒酵母GSH I基因的克隆、表达与结构分析

宋冬梅，朱益波，周丽丽，郑丽雪，齐 斌，*

(1.吉林农业大学，食品科学与工程学院，吉林长春130118;2.常熟理工学院发酵工程技术研究中心，苏州食品生物技术重点实验室，江苏常熟215500)

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是在γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)的连续催化下合成的含巯基活性三肽，具有解毒、抗氧化和抗衰老等重要的生理功能［1－3］，在食品、医药和生物等领域有着广泛地应用［4－7］。但是我国GSH的生产满足不了市场的需求。近年来，GSH生产研究的热点是利用DNA重组技术构建高产GSH的重组菌。Murata等［8］构建了具有较高GSH催化活性的重组 Escherichia coli。沈立新等［9］构建了含 GSH I及GSHⅡ基因的质粒pTrc－gsh，并在E.coli中得到了活性表达。Liao等［10］构建的E.coli GSH I和GSH Ⅱ基因融合表达质粒，提高了胞内GSH含量。这些研究在一定程度上提高了重组菌GSH的产量，但总的来说都不理想。GSH I是GSH合成途径的关键酶和限速酶［11］，构建高GSH I活性的菌株将有助于提高重组菌GSH的产量。本文从实验室保存的一株高产GSH的Saccharomyces cerevisiae 2－10515出发，采用PCR技术扩增得到GSH I基因，并在E.coli中实现表达，同时利用生物信息学方法对GSH I基因序列和结构进行分析和预测，为进一步提高GSH I表达量和活性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

S.cerevisiae 2－10515、E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)、质粒pET－28a 本实验室保藏;DNA限制性内切酶Sac I和HindⅢ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、pMD19－T 载体、DNA Marker、质粒小量提取试剂盒、DNA纯化及胶回收试剂盒等 TaKaRa公司;其他试剂 均为国产分析纯;YEPD培养基、LB培养基 配方见文献［12］。

高速台式离心机Legend Micro 17R Thermo公司;PCR仪、Gel Doc XR、水平电泳系统、垂直电泳系统、凝胶电泳成像仪 Bio－RAD公司;恒温金属浴Eppendorf公司;SW－CJ－ZF净化工作台 苏州净化设备有限公司;恒温培养箱 太仓市华美生化仪器厂;电子天平 Mettler公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计 根据Gene bank里已公布的S.cerevisiae S288c的gsh I基因设计引物，分别在上游和下游引物中引入酶切位点Sac I和HindⅢ:

P1(Forward):CACGAGCTCATGGGACTCTTAGCTTT酶切位点Sac I

P2(Reverse):CCCAAGCTTTTAACATTTGCTTTCTA酶切位点HindⅢ

1.2.2 克隆载体的构建 采用周小玲等人［13］的方法提取S.cerevisiae 2－10515的基因组 DNA，以其为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增，得到gsh I基因。PCR 反应参数为:95℃ 5min;94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min(30cycles);72℃ 10min。将gsh I连接到克隆载体pMD19－T上，构建克隆质粒 pMD19－T－gsh I，并转化E.coli JM109，得到E.coli JM109(pMD19－T－gsh I)，提取克隆质粒进行酶切验证，送上海生工生物有限公司测序。

1.2.3 E.coli重组表达载体的构建 分别用限制性内切酶Sac I和HindⅢ酶切克隆质粒pMD19－T－gsh I和质粒pET－28a，酶切产物经胶回收纯化，16℃连接过夜，转化E.coli DH5α。抽提重组质粒，经酶切验证后测序。

将重组表达质粒 pET－28a－gsh I热激转化到E.coli BL21(DE3)。

1.2.4 GSH I的诱导表达 挑取单菌落接入LB培养基(含100mg/mL Amp)，37℃培养至 OD550为 0.5左右时，在34℃，IPTG(0.1mmol/L)条件下，诱导表达。

1.2.5 SDS－PAGE检测 按《分子克隆》［14］操作说明进行SDS－PAGE电泳后，考马斯亮蓝R－250染色，脱色过夜，观察结果。

1.2.6 GSH I酶活性的测定 取5mL培养液12000×g离心5min，弃上清，用50mmol/L，pH7.0的磷酸缓冲液洗涤，离心后收集菌体。用同样的磷酸缓冲液4mL悬浮菌体后超声波破碎［15］，加入GSH前体反应液(谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸浓度均为40mmol/L，MgCl2和ATP浓度均为50mmol/L，GSH I浓度为2g/L)4mL，37℃反应 30min，沸水浴 2min以终止反应，用ALLOXAN试剂法［16］测GSH的生成量。酶活力单位(U)定义为37℃，pH7.0条件下，每分钟催化合成1μg GSH所需的酶量。

1.2.7 GSH I的结构分析 利用DNAMAN软件推导出目的基因的氨基酸序列，分析其与Gene bank数据库中其它物种同源蛋白氨基酸序列的一致性。

通过蛋白分析专家系统(ExPASy，http://ca.expasy.org/)提供的分析工具分别预测蛋白质的理化性质、一级结构和二级结构。

利用3D－JIGSAW模拟GSH I的三级结构。

2 结果与分析

2.1 基因克隆

以S.cerevisiae 2－10515基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，扩增产物纯化后电泳结果见图1。图1显示:目的条带在2000bp附近，与预计的条带大小相吻合。

图1 gsh I基因的PCR纯化产物Fig.1 PCR purification product of gsh I

2.2 重组表达载体的构建

成功构建的表达载体pET－28a－gsh I的结构示意图如图2。将其用Sac I和HindⅢ酶切鉴定，结果如图3。经酶切的重组质粒含有单一的约2Kb插入片段，这表明gsh I基因已插入质粒pET－28a中。测序结果证明阅读框插入位点正确。

图2 重组表达载体pET－28a－gsh I结构示意图Fig.2 Construction of recombinant expression plasmid pET－28a－gsh I simple

图3 重组质粒pET－28a－gsh I/Sac I+HindⅢ酶切鉴定Fig.3 pET－28a－gsh I digested by Sac I and Hind Ⅲ

2.3 SDS－PAGE电泳分析

SDS－PAGE电泳后考马斯亮蓝染色，脱色过夜，观察结果如图4所示:2、3、4泳道与阴性对照(1泳道)相比，在81Ku附近有一条明显的蛋白条带，除去载体上的his－tag(分子量约为3ku)，其实际的蛋白质分子量约为78ku，与预测的GSH I蛋白大小相符，很可能为表达的GSH I蛋白，该蛋白以融合蛋白的形式存在。

图4 SDS－PAGE分析图谱Fig.4 SDS－PAGE analysis of expression products

2.4 酶活力的测定

重组菌的GSH I活力测定结果见图5，34℃诱导4h时，其活力达到46.09U/mg湿菌，随着诱导时间的延长，GSH I活力并没有增加，最佳诱导时间为4h。优化各种表达条件，酶活力无明显改善。

图5 重组菌GSH I酶活力曲线Fig.5 GSH I enzymatic activity curve of recombinant strain

2.5 GSH I基因的结构分析

2.5.1 Blast分析结果 该基因全长为2037bp，编码678个氨基酸。对GSH I氨基酸序列进行同源多重序列比对(如图6)发现:序列中部为保守序列，其关键氨基酸都在该保守序列中;与Gene bank中S.cerevisiae S288c、Macaca mulatta、Musmusculus、Branchiostoma floridae同源基因的氨基酸序列一致性分别为99%、42%、42%、41%。

图6 GSH I的Clustal多重序列比对Fig.6 Multiple alignment of GSH I by Clustal

2.5.2 GSH I蛋白质的理化性质 利用ExPASy中ProtParam预测GSH I的理论分子量为78281.6u;等电点为5.87;含有9个半胱氨酸;其中第164位和第642位半胱氨酸有形成二硫键的可能性;该蛋白质的性质不稳定，在溶液中的不稳定指数为42.19，高于阈值40;脂溶性指数为77.52;亲水指数(GRAVY)为－0.507，为亲水性蛋白。其成熟肽N端为蛋氨酸时，在哺乳动物网状红细胞体外表达的半衰期为30h，在酵母和大肠杆菌中表达的半衰期分别为20、10h。

2.5.3 GSH I的二级结构 利用ExPASy中PredictProtein分析蛋白的拓扑结构和二级结构，该蛋白没有信号肽，为非分泌蛋白;在253～272aa、285～308aa和484～511aa处有三个跨膜区;α－螺旋∶延伸链:β－折叠∶无规则卷曲 =35.10∶16.52∶8.85∶39.53，表明蛋白质二级结构的主要结构元件是α－螺旋和无规则卷曲，具有较多的无规则卷曲，不利于其稳定;mRNA的二级结构在起始密码子处形成发卡结构。

2.5.4 GSH I的三级结构 将GSH I的氨基酸序列提交到3D－JIGSAW服务器预测GSH I三级结构，用Pymol软件打开，如图7所示，发现酶结构较松散，侧链间相互作用不强，这与ProtParam的预测结果相一致。

图7 GSH I三级结构图Fig.7 3D structure of GSH I

3 结论与讨论

已有学者在S.cerevisiae和Pichia pastoris中表达了 GSH I［17－18］，但这些报道中 GSH I 的表达量不高，酶活力也较低，使得构建好的菌株无法达到工业化生产的要求。S.cerevisiae是高产GSH的菌株，将其GSH I在E.coli中表达，有望构建高活性的GSH I重组菌，为工业化生产GSH奠定基础。本研究成功克隆了S.cerevisiae 2－10515的gsh I基因，将编码GSH I的基因定向克隆到pET－28a载体上，构建了重组菌株 E.coli BL21(DE3)/pET－28a－gsh I，34℃ 诱导 4h时，活力达到 46.09U/mg 湿菌，高于 Fan［17］、饶志明［18］等构建的重组菌株。

利用生物信息学方法分析S.cerevisiae 2－10515 GSH I序列可知:a.gsh I基因转录出的mRNA在5＇端起始部位区形成了发卡结构，有研究证实这种发卡结构会遮蔽SD序列和起始密码子部位能阻止30s核糖体亚基的结合，从而减慢翻译起始频率［19］，降低相应蛋白质的表达量。B.GSH I在溶液中的不稳定指数为 42.19，高于阈值 40;GSH I亲水指数为－0.507，为亲水性蛋白;该酶分子中含有较多的无规则卷曲，结构比较松散。这些都说明GSH I稳定性较差［20］，不利于活性的提高。所以，从基因水平对S.cerevisiae 2－10515进行分子改造能进一步提高该酶的表达量和活性。

Huang［21］通过对 mRNA 结构的改造，消除了起始密码子附近mRNA的二级结构，从而提高了木聚糖酶的表达量;Jeong［22］、Mahadevan［23］等通过同源建模及结构分析，利用定点突变增加了酶的稳定性。这些研究都为后续对S.cerevisiae GSH I分子改造提供了很好的基础。本文在 E.coli中成功表达了S.cerevisiae来源的GSH I，为工业应用奠定了基础;并对其进行了初步的生物信息学分析，为后续研究指明了方向。

［1］Grill E，Löffler S，Winnacker E L，et al.Phytochelatins，the heavy metal binding peptides of plants，are synthesized from glutathionebyaspecific γ－glutamylcysteine dipeptidyl transpeptid－adse(phytochelatin synthase)［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86:6838－6840.

［2］ MeisterA.Glutathione metabolism and its selective modification［J］.Biol Chem，1988，263:27205－27208.

［3］Sanchez－Femandez R，Fricker M，Corben L B，et al.Cell proliferation and hair tip growth in the Arabidopsis root are under mechanistically different forms of redox control［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94:2745－2750.

［4］杨培慧，齐剑英.谷胱甘肽的应用及其检测方法［J］.中国生化药物杂志，2002，23(1):52－54.

［5］冮洁，单立峰.谷胱甘肽的制备及其应用［J］.饲料工业，2007，28(15):15－17.

［6］周宇光，付国平，肖仔军.谷胱甘肽的生产和应用研究进展［J］.食品工业科技，2003，24(3):89－91.

［7］Spector D，Laban J，Toledanom B.A genetic investigation of the essential role of glutathione［J］.Biol Chem，2001，276(10):7011－7016.

［8］Murata K，Miya T，Gushima H，et al.Cloning and amplification of a gene for glutathione synthetase in E.coli B［J］.A gric Biol Chem，1982，47:1381－1383.

［9］沈立新，魏东芝，赵哲峰，等.谷胱甘肽合成酶系的克隆、测序与表达［J］.生物工程学报:2001，17(1):98－100.

［10］Liao X Y，Shen W，Chen J.Improved glutathione production by gene expression in Escherichia coli［J］.Letters in Applied Microbiology，2006，43:211－214.

［11］Ohtake Y，Watanabe K，Tezuka H，et al.Expression of glutathione synthetase gene of Escherichia coli B in Saccharomyces cerevisiae［J］.J Ferment Bioeng，1989，68(6):390－394.

［12］黄培堂 .分子克隆实验指南［M］.北京:科学出版社，2005.

［13］周小玲，沈微，饶志明，等.一种快速提取真菌染色体DNA 的方法［J］.微生物学通报，2004，31(4):89－92.

［14］Sambrook J，E F Fritsch，T Maniatis.Molecular cloning:A laboratory manual(Second edition)［M］.NY:Cold spring harbor laboratory，1989.

［15］沈立新，魏东芝，赵哲峰，等.谷胱甘肽合成酶在大肠杆菌中的高效表达及性质［J］.华东理工大学学报，2000，26(4):342－345.

［16］李从军，谢爱娣.酵母提取液中谷胱甘肽定量测定方法的比较［J］.食品发酵工业，2010，36(7):158－162.

［17］Fan XY，He XP，Guo XN，et al.Increasing glutathione formation by functional expressing of the γ－glutamylcysteine synthetase gene in Saccharomyces cerevisiae［J］.Biotechnol Lett，2004，26(5):415－417.

［18］饶志明，艾丽静，沈微，等.gsh I基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达［J］.应用与环境生物学报，2007，13(2):257－260.

［19］Cruz－Vera L R，Magos－Castro M A，Zamora－Romo E，et al.Ribosome stalling and peptidyltRNA drop－ off during translational delay at AGA codons［J］.Nucleic Acids Res，2004，32(15):4462－4468.

［20］王大成.蛋白质工程［M］.北京:化学工业出版社，2002.

［21］Huang H Q，Yang P L，Luo H Y，et al.Hingh－level expressin of a truncated 1，3－1，4－β－D－glucanase from Fibrobacter succinogenes in Pichia pastoris by optimization of codons and fermentation［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，78(1):95－103.

［22］Jeong M Y，Kim S，Yun C W，et al.Engineering a denovo internal disulfide bridge to improve the thermal stability of xylanase from Bacillus stearothermophilus No.236［J］ .J Biotechnol，2007，127(2):300－309.

［23］Mahadevan S A，Wi S G，Lee D S，et al.Site－directed mutagenesisand CBM engineering ofCel5A(Thermotoga maritima)［J］.FEMS Microbiol Lett，2008(2):205－211.