李小多,李学刚,张 波,宋尚华,刘旭晶,叶小利,*
(1.西南大学生命科学学院,重庆400715;2.西南大学药学院,重庆400716)
血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)在肾素-血管紧张素系统中具有调控血压的重要作用[1],主要催化血管紧张素Ⅰ转化为具有较强升压作用的血管紧张素Ⅱ[2]。目前市场上降压效果较好的卡托普利(caporal),依那普利(enalapril)等[3]大多是合成药物,长期服用都会有不同程度的副作用,如咳嗽、心血管疾病、皮疹、血管性水肿等[4]。我国中药资源丰富,且有悠久的用药历史,筛选对ACE具有强抑制活性的中药对降压药物的开发具有重要的意义。本实验采用体外模型[5],以马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu,HHL)为ACE反应底物,产物马尿酸(HIP)为测定指标,HIP的生成量与ACE的活性正相关。以ACE为靶点,用高效液相色谱法(HPLC)[6]测定了32味中药提取物和活性部位对ACE的抑制作用,筛选出了枸杞以及枸杞提取物的降压活性部位,并对枸杞活性部位进行纯化。目前对枸杞以ACE为靶点研究其降血压功能尚未见报道,因此,本研究结果为枸杞降血压的研究及相关药品开发奠定了一定基础。
兔肺 中国人民解放军第三军医大学;叶黄素、山茱萸、丹皮、天花粉、首乌、黄芩、白芍、沙参、木香、菟丝子、桑叶、女贞子、茯苓、玄参、山药、熟地黄、玉竹、天门冬、太子参、桔梗、麦冬、菊花、淫羊藿、人参、泽泻、决明子、知母、山楂、五味子、黄芪、佛手、枸杞
购于重庆市安康大药店;HIP、HHL Sigma公司;东莨菪苷 上海源叶生物科技有限公司;甲醇为色谱纯 天津市科密欧化学试剂有限公司;其他试剂均为分析级。
LC-20AD型高效液相色谱仪 日本岛津;RRH-250型万能高速粉碎机 欧凯莱芙宝业公司;KQ5200DA型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;pH5-3C+型酸度计 四川成都方舟科技有限公司;Avanti J-30i高速冷冻离心机 美国Beckman;HHW-21CU-600恒温水浴锅 上海福玛实验设备有限公司;TG16-W微量高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。
色谱柱:ODS-BP(4.6mm ×200mm,5μm),流动相为甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(25∶75,v/v);检测波长 228nm,流速 1.0mL/min,柱温 37℃,进样量 20μL[2]。
根据文献[7-8]方法,加以改进,所有操作均在冰水混合物中进行。兔肺用0.9%NaCl漂洗至洗液无血红色,剪至碎块,4℃冷藏过夜,兔肺与硼酸盐缓冲液(SSB,0.1mol/L,p H8.3)固液比(g∶mL)1∶5 混合,转入组织匀浆机中,间歇匀浆(每匀浆20s放入冰箱冷冻30s,反复3次),4℃冷藏6h使浸提物充分溶出。在4℃、700×g离心20min,弃沉淀,上清液在4℃、37000×g离心1h,上清液即为ACE粗酶,-20℃储存备用。
根据文献[9]的方法,适当改进,设计ACE粗酶体积分别为 10、20、40、60、80μL,加入 SSB、HHL 和ACE 总体积 200μL,37℃ 孵化 40min,加入 300μL 1mol/L HCl溶液终止反应,10000r/min离心10min,HPLC检测HIP峰面积。
中药材粉碎,过100目筛,称取各药材2.0g,加入体积分数为75%的乙醇提取,料液比(g∶mL)1∶10,常温超声(100W,20kHz)提取30min,即为中药提取物,浓度为0.1g/mL,4℃保存备用。
1.6.1 枸杞大孔树脂活性部位的制备 枸杞60℃烘干至恒重,粉碎后过100目筛,石油醚脱脂、脱色素1h[10-11],体积分数为 75% 的乙醇,料液比(g∶mL)1∶16,75℃回流提取 2h,残渣重复提取 1次,合并提取液,75℃浓缩至恒重。浸膏过D-101大孔树脂,用水、不同体积分数的乙醇(25%、50%、75%、95%)梯度洗脱,洗脱液分别浓缩烘干成浸膏待用。
1.6.2 枸杞硅胶活性部位的制备 将枸杞大孔树脂抑制率最高的部位60℃烘至恒重,与硅胶(100~200目)质量比1∶1拌样烘干,按质量比1∶50装柱,然后用不同体积比的乙酸乙酯/甲醇作为洗脱剂梯度(9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5,纯甲醇和 0.2% 醋酸甲醇)洗脱得 A、B、C、D、E、F、G 七个部位。分别浓缩烘干成浸膏待用。
1.6.3 ACE抑制成分的分离及鉴别 将枸杞硅胶抑制率最高的部位60℃烘至恒重,用硅胶(200~300目)柱进一步分离纯化,得到两个化合物,以薄层色谱(TLC)进行定性分析,经核磁(1H-NMR,13C-NMR)鉴定,最终推测枸杞中抑制ACE的主要活性成分。
加样量及顺序如表1,37℃温浴5min后,加入20μL的ACE粗酶启动反应,37℃孵化40min,加入300μL 1mol/L HCl溶液终止反应,反应总体积为500μL,10000r/min离心10min,HPLC 检测 HIP 峰面积(S)。药物抑制率按下式计算:
抑制率 I(%)=(S对照-S药物)/(S对照-S空白)×100 ACE抑制剂活性用 IC50值表示。IC50为抑制剂对ACE抑制率达到50%时抑制剂的量。
表1 ACE反应体系(μL)Table 1 ACE reaction system(μL)
由图1可以看出,酶蛋白的体积和HIP峰面积之间有良好的线性关系,说明此法可以精确检测ACE的活性,能够反映酶与底物的反应程度,从而确定酶的合适剂量。
图1 HIP峰面积与ACE体积变化的关系曲线Fig.1 Relation curve of HIP peak area with ACE volume
本实验将中药提取物分别配成10、20、40mg/mL 3个浓度,且3个浓度的实验结果呈很好的线性关系,表2是20mg/mL药物浓度的实验数据。由表2可知,32味药材中,叶黄素、山茱萸、丹皮、天花粉、首乌、黄芩、白芍、沙参、木香、菟丝子对ACE没有抑制作用;其他药物对ACE都有一定的抑制作用,泽泻、决明子、知母、山楂、五味子、黄芪、佛手、枸杞对ACE的抑制率都高于60%,其中枸杞的抑制率最高,达到92.30%,说明枸杞中含有能有效抑制ACE的活性成分。因此,选取枸杞进行下一步的研究。HIP标准品、阴性对照及枸杞提取物反应液HPLC图见图2。由图2(B)可知,阳性对照体系(SSB+HHL+ACE)反映了ACE具有很高的活性;由图2(C)可知,枸杞反应液体(SSB+HHL+ACE+枸杞提取物)当加入抑制剂时,HIP生成量明显减少,ACE活性受到抑制。
表2 药物对ACE的抑制率(%)Table 2 ACE inhibitor rate of traditional Chinese medicines(%)
图2 HIP对照品(A)、阴性对照(B)、枸杞提取物反应液(C)的HPLC图Fig.2 HPLCchromatograms of HIPreference substances(A),negative sample(B),and reaction liquid of Lycium barbarum L.extracts(C)
枸杞提取物总浸膏以及总浸膏经D-101大孔树脂后得到未吸附、水洗脱及25%、50%、75%、95%乙醇洗脱的6个活性部位,浓缩蒸干,配成浓度为0.1mg/mL的溶液。经HPLC法分别检测各部位对ACE活性的抑制作用,各部位对ACE活性的抑制率如表3,由表3可知,水洗脱部位、95%的乙醇洗脱部位对ACE的抑制作用较小。总浸膏、未被大孔树脂吸附的部位、25%、50%、75%乙醇洗脱部位对ACE活性均有抑制作用,其中50%乙醇部位的抑制率最高,抑制率为35.46%。因此,选取50%乙醇部位进一步纯化。
表3 大孔树脂活性部位对ACE的抑制率Table 3 ACE inhibitor rate of eluted fractions from D-101 macroporous adsorption resins
枸杞大孔树脂的50%洗脱部位经硅胶柱吸附,根据1.6.2得到的 A、B、C、D、E、F和 G 7个活性部位,浓缩蒸干,配成浓度为0.1mg/mL的溶液。经HPLC分别检测各部位对ACE活性的抑制作用,各部位对ACE的抑制率如表4。由表4可知,G洗脱部位对ACE无抑制作用;其它的活性部位对ACE活性均有抑制作用,其中D洗脱部位的抑制率最高,达到56.26%。
表4 枸杞活性部位对ACE的抑制率Table 4 ACE inhibitor rate of eluted fractions from silica gel
将枸杞硅胶洗脱的D部位用硅胶进一步分离纯化,并对得到的化合物1和2进行ACE活性测定,由表5可见,化合物1的抑制率为96.67%,而化合物2的抑制率为26.56%,所以可以初步断定枸杞中抑制ACE活性物质是化合物1。化合物1的核磁波谱数据为:紫外灯(365nm)下显强蓝色荧光。1H-NMR(500Hz,CD3OD)δ:7.89(1H,d,J=9.5Hz,H-4),7.34(1H,s,H-5),7.20(1H,s,H-8),6.29(1H,d,J=9.5Hz,H-3),3.90(1H,s,OCH3),5.11(2H,d,J=3.5Hz),3.18~3.69(多重峰);13C-NMR(500Hz,CDCl3)δ:163.8(C-2),114.6(C-3),144.7(C-4),110.7(C-5),148.1(C-6),151.7(C-7,C-8a),103.6(C-8),113.1(C-4a),57.1(OCH3),60~80 之间碳的个数和其化学位移显示包含单糖信号[12-13],特征峰与东莨菪苷对照品基本一致[14],从其波谱数据可以确定化合物1是一种东莨菪糖苷类物质。化合物2核磁波谱数据为:紫外灯(365nm)下显强蓝色荧光,黄色针状结晶(CHCl3)。1H-NMR(500Hz,CDCl3)δ:7.59(1H,d,J=9.5Hz,H-4),6.92(1H,s,H-5),6.85(1H,s,H-8),6.26(1H,d,J=9.5Hz,H-3),3.96(1H,s,OCH3);13C-NMR(500Hz,CDCl3)δ:113.5(C-3),143.2(C-4),107.2(C-5),149.8(C-6),150.2(C-7,C-8a),103.2(C-8),111.5(C-4a),56.3(OCH3)。通过与文献[15-16]对照,将化合物2鉴定为莨菪亭(scopoletin),化合物1和2为同系物。推测枸杞中抑制ACE活性的主要成分可能是香豆素类化合物中的一种东莨菪糖苷类物质。
表5 化合物对ACE的抑制率Table 5 ACE inhibitor rate of compound
3.1 血管紧张素转化酶(ACE)的活性与血压的高低直接正相关,有效的抑制ACE的活性,就能在高血压的治疗中取得显著的效果。因此,筛选能有效抑制ACE活性的中药具有重要意义。本实验用HPLC测定了32味中药对ACE活性的抑制情况,结果表明,泽泻、决明子、知母、山楂、五味子、黄芪、佛手、枸杞对ACE均有一定抑制,其中枸杞的效果最好,为进一步研究和开发枸杞作为降血压药物奠定了基础。对ACE无抑制作用的药物可能是其降压机制不是以ACE为靶点,而是通过其他途径使血压降低,或者这些药物本身无降压作用,这个问题有待进一步研究。
3.2 目前对枸杞以ACE为靶点研究其降血压功能的研究尚未见报道。本实验通过对枸杞乙醇提取液进行大孔树脂吸附,以乙醇梯度洗脱,经HPLC测定了枸杞各部位对ACE的抑制作用。实验结果表明,50%的乙醇洗脱液对ACE有最强抑制作用。乙醇体积分数过低有效成分未能充分解吸附,而乙醇体积分数过高会把色素等杂质冲洗下来,从而影响有效成分的富集,所以50%的乙醇对于抑制ACE酶的有效成分的解吸附最适宜。对50%的乙醇部位用硅胶进一步纯化,结果发现D洗脱部位对ACE的抑制率达到56.26%,说明硅胶能有效的纯化枸杞中对ACE有抑制效果的活性物质。通过对D洗脱部位进一步的分离纯化,结果得到两个化合物,东莨菪糖苷类化合物的抑制率为96.67%,莨菪亭的抑制率为26.56%,通过核磁鉴定,推测枸杞中抑制ACE活性的主要物质可能为香豆素类化合物中的一种东莨菪糖苷类物质。本实验结果丰富了枸杞的药用价值,开辟了枸杞降血压的新途径;但抑制ACE活性的具体成分、化学结构和作用机制有待进一步研究。
[1]Ju-eun Lee,In Young Bae,et al.Tyr-Pro-Lys,an angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide derived from broccoli(Brassica oleracea Italica)[J].Food Chemistry,2006,99:143-148.
[2]曹晓刚,于刚,叶小利,等.中药提取物及活性部位抑制血管紧张素转化酶活性的研究[J].食品与药品,2009,11(1):20-23.
[3]Marlene L Cohen.Synthetic and fermentation-derived Angiotensin-Converting Enzyme inhibitors[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,1985,25:307-323.
[4]Tarek F T Antoniios,Graham A Macgregor.Angiotensinconverting-enzyme inhibitors in hypertension:potential problems[J].Journal of Hypertension,1995,13(3):11-16.
[5]程艳霞,任昉,何林.血管紧张素转化酶抑制剂体外筛选模型的建立[J].华西医学,2004,19(4):590-591.
[6]Lahogue V,Réhel K,Taupin L,et al.A HPLC-UV method for the determination of angiotensin I-converting enzyme(ACE)inhibitory activity[J].Food Chemistry,2010,118:870-875.
[7]吴琼英,马海乐,崔恒林,等.猪肺血管紧张素转化酶的提取纯化及其性质研究[J].食品科学,2004,25(9):71-74.
[8]V K Jimsheena,Lalitha R Gowda.Arachin derived peptides as selective angiotensin I-converting enzyme(ACE)inhibitors:Structure-activity relationship[J].Peptides,2010,31:1165-1176.
[9]陈洪源,明智强,李学刚,等.苍术提取物对血管紧张素转化酶的抑制活性[J].重庆工商大学学报,2008,25(4):419-422.
[10]贾韶千,吴彩娥,杨剑婷,等.枸杞中黄酮类化合物纯化工艺的研究[J].南京林业大学学报,2010,34(2):85-88.
[11]孔令明,李芳,苏兴成.枸杞中黄酮类化合物的提取研究[J].食品研究与开发,2008,29(8):45-48.
[12]周慧斌.香果树化学成分及其生物活性研究[D].上海:第二军医大学,2008.
[13]张光浓,张朝凤,罗英,等.球花石斛的化学成分(Ⅱ)[J].中国天然药物,2005,3(5):287-290.
[14]朱华勇.藏药马尿泡化学成分的研究[D].成都:西南交通大学,2011.
[15]康胜利,刘明生.海南梧桐化学成分的研究[J].时珍国医国药,2007,18(4):797-798.
[16]李春生,杜春芝,赵全成,等.枸杞子化学成分的研究[J].中国中药杂志,1990,15(3):43-44.