18种老化指示物质在啤酒发酵过程中的变化研究

尹 花，田玉红，郝俊光，董建军

(啤酒生物发酵工程国家重点实验室(筹)，青岛啤酒股份有限公司，山东青岛266061)

啤酒新鲜度是消费者非常关注的品质指标，也是各大啤酒公司关注的关键指标。由于中国啤酒的酿造普遍使用高浓高辅(麦汁浓度高，高辅料比)技术，酒液日趋淡爽，造成酒基对老化风味的掩盖效果下降，使得新鲜度问题变得更为突出。对啤酒老化的集中研究可追溯于上世纪60年代，Vanderhaegen［1］等对目前已确认的与啤酒老化相关的物质进行了汇总。目前，人们普遍接受的老化机理包括脂质氧化［2］、氨基酸降解［3-4］、高级醇氧化、Maillard 反应［5］、酯化、内酯化［6］等。通常情况下老化物质是低于其阈值水平的，但不同老化物质共同作用会导致老化味的产生。本文将在检老化物质定义为老化指示剂，这些物质含量的变化与老化风味的强弱有一定的关联，在一定意义上可以指示啤酒老化的程度。在检物质可以根据老化机理和指示作用的不同，进一步分为氧负荷指示剂、热负荷指示剂和脂质氧化指示剂，用于指示在酿造过程中所受到的氧、热情况以及原料新鲜度对酿造过程的影响。以往对啤酒新鲜度的研究主要集中于老化物质检测方法的开发和对成品啤酒贮存过程的研究［1，7-8］，对酿造过程老化物质变化的研究报道较少。随着研究的深入，将研究过程前移，考察酿造过程中相关老化物质的变化情况及影响因素是国内外新鲜度调控工作的主要研发方向。针对目前酿造过程的报道主要是基于Ale啤酒的研究［9-10］，而国内Lager酵母酿造淡爽型啤酒的过程研究尚待进行的现状，本研究选择代表不同指示作用的18种老化物质为研究对象，在建立SPMEGCMS 检测方法［7-8，11-12］的基础上，对其在酿造过程的变化趋势进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、戊醛、己醛、糠醛、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、反-2-壬烯醛、糠基乙醚、乙酰呋喃、5-甲基糠醛、苯甲醛、烟酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、γ-壬内酯、大马烯酮 美国Sigma公司;乙醇 色谱纯，德国Merck公司;超纯水≥18.2MΩ。

Milli-Q plus纯水仪 德国Millipore公司;固相微萃取自动进样器 瑞士CTC公司;65μm PDMSDVB、65μm DVB/Carboxen/PDMS固相微萃取纤维美国 Supelco公司;Clarus600 GC-MS 美国PerkinElmer公司;DB-5MS(60m ×250μm ×0.25μm)色谱柱 美国Agilent公司。

1.2 测定方法

1.2.1 老化醛的检测方法［8，11］啤酒酿造过程样品的取样点分别为:冷麦汁、满罐、主酵、后熟、冷贮、成品。

2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、戊醛、己醛、糠醛、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、反-2-壬烯醛的检测使用SPME-GCMS柱上衍生技术。检测步骤如下:a.啤酒排气，发酵液和麦汁过滤。在20mL顶空瓶中加2g NaCl。b.取5mL样品到20mL顶空瓶，添加50μL内标物质对氟苯甲醛(原液稀释105倍)，旋紧瓶口。c.将65μm PDMS-DVB固相微萃取纤维插入装有10mL、60mg/L O-(2，3，4，5，6-五氟苄基)羟胺(PFBOA)的顶空瓶中，以顶空方式50℃衍生15min。d.将萃取纤维再放入待测样品顶空瓶中，以顶空方式50℃萃取待测物质45min。e.上机检测。GC条件:色谱柱 DB-5ms 60m ×320μm ×0.25μm。载气为氦气，流速1mL/min，进样口温度250℃，无分流进样。程序升温:40℃保温2min;以10℃/min升到140℃;以7℃/min升到250℃;250℃保温3min。MS条件:电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV;GC-MS接口温度250℃;离子源温度230℃;四极杆温度150℃;扫描范围50～550amu。羰基化合物的PFBOA衍生物的定性采用质谱全扫描方式，标准物质定性，定量采用选择离子(61、181m/z)扫描方式。f.物质的定量采用以啤酒为基体的外标系列曲线法。

1.2.2 非醛类老化指示剂的集约化检测方法 糠基乙醚、乙酰呋喃、5-甲基糠醛、苯甲醛、烟酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、γ-壬内酯、大马烯酮均为代表不同老化反应途径的老化指示剂，为区别于老化醛的衍生检测技术，将这些物质的检测方法称为集约化老化测定方法。检测步骤如下:a、b步骤同1.2.1步骤 a、b。c.将 65μm DVB/CARBOXEN/PDMS 固相微萃取纤维插入待测样品瓶中，以顶空方式50℃萃取40min。d.上机检测。GC条件:色谱柱DB-5ms 60m×320μm×0.25μm 载气为氦气，流速1.5mL/min。进样口温度250℃。无分流进样。程序升温:40℃保温2min;以 3℃/min升到 130℃;以 45℃/min升到250℃;250℃保温2min。MS条件:电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV;GC-MS接口温度250℃;离子源温度230℃;四极杆温度 150℃;扫描范围 35～200amu，标准物质用于定性;SIM模式用于物质的定量，不同物质的定量离子不同。e.物质的定量方法同1.2.1 f。

2 结果与分析

2.1 酿造过程中老化醛类的变化趋势

跟踪工厂的酿造过程，分析冷麦汁、满罐、主酵、后熟、冷贮、成品酒中的老化醛类物质的含量。酿造过程为:13°P麦汁，满罐时添加酵母，酵母添加量达2 ×107/mL，9.5℃主酵 110h，12℃后熟 13d，-1.0℃冷贮10d。冷贮酒经稀释后得到8°P成品酒，根据稀释倍数进行相应换算。冷麦汁和满罐样品的老化醛对比见图1，发酵过程的老化醛类变化见图2。

图1 冷麦汁和满罐样品中老化醛的含量差异Fig.1 Difference of aging aldehyde in cold wort and full tank sample

Strecker醛是氨基酸降解的产物，通常作为贮存过程氧负荷指示剂，其可在麦芽醅焦、糖化、麦汁煮沸、杀菌、贮存过程中形成。在成品啤酒中，Strecker醛类也可以通过高级醇氧化产生。由图1可知，与麦汁相比，满罐时样品中所有醛类降到非常低的水平。其中，Strecker醛中的2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛和苯乙醛分别由75.61、33.63、146.30、49.37、133.57μg/L 下降至满罐时的3.88、1.83、8.44、1.85、3.71μg/L。

反-2-壬烯醛、己醛、戊醛是不饱和脂肪酸降解的产物，通常作为原料新鲜度的指示剂，在啤酒的贮存过程中这些醛类会升高。不饱和脂肪酸及其中间产物的氧化分为酶促氧化和非酶促氧化，即不饱和脂肪酸的氧化受到脂肪酶、脂肪氧合酶(LOX)、过氧化物酶等的作用，也会发生受温度和光影响的自氧

图2 发酵过程中老化醛的变化趋势Fig.2 Variation of aldehyde in fermentation process

2.2 酿造过程中集约化方法检测的老化指示物质的变化趋势

同一个酿造过程中集约化方法检测的老化指示物质的变化趋势见图3。

图3(a)显示，乙酸苯乙酯在发酵过程中大幅增加，源自发酵过程中乙酸和苯乙醇的大幅增加，二者反应生成大量的乙酸苯乙酯。乙酸苯乙酯为乙酸酯类化合物，具有水果香气，是新鲜啤酒的正面风味。在发酵过程中，由满罐时的10.9μg/L大幅增至522.6μg/L，在随后的冷贮至成品过程中略有下降，由冷贮酒中的 527.9μg/L下降至成品酒中的430.3μg/L。

图3 发酵过程中集约化方法检测的老化指示物质的变化趋势Fig.3 Variation of compouds in centralized detection method in fermentation process

γ-壬内酯为内酯类化合物，在发酵过程中亦有较大的增高(图3(b))。主酵结束后，由冷麦汁中的3.3μg/L增长至27.1μg/L，其增长是酵母代谢脂肪酸的结果。γ-壬内酯本身是椰子味，不是不愉快的味道，但其甜味降低了淡爽啤酒的新鲜感，从而被认为是一种老化指示物质。此外，γ-壬内酯与反-2-壬烯醛的老化协同作用［6］，将增加啤酒的老化味。大马烯酮在发酵过程中小幅增加，由0.5μg/L升至1μg/L。该物质是由类胡萝卜素衍生来的一类羰基化合物中的一种，呈水果香味，其在啤酒贮存过程中会上升［16］。

苯甲醛和5-甲基糠醛也是醛类化合物，跟其它醛类物质一样，在发酵初期因酵母还原而含量下降(图3(c))。在包装形成成品过程中，高温杀菌造成5-甲基糠醛有较大幅度的上升。

糠基乙醚、乙酰呋喃及苯乙酸乙酯(图3(d)～图3(e))在发酵过程中含量略有波动，变化趋势不明显。烟酸乙酯含量略有上升。糠基乙醚自身呈溶剂味［17］，实验证实酵母对糠基乙醚无转化能力，即在成品酒中添加酵母将极大地改善纸板味(反-2-壬烯醛)等老化味，但对糠基乙醚的溶剂味没有改善［18］。烟酸乙酯和乙酸乙酯同属乙酯类，在发酵过程中含量不大，但会在成品啤酒贮存过程中因多量乙醇的存在而明显升高［1］。乙酰呋喃作为麦德拉反应产物，其在啤酒贮存过程中逐渐上升，与啤酒所受热负荷直接相关，是啤酒的又一热负荷指标。但由于含量较低，在酿造过程的变化趋势不明显。

综上所述，在啤酒发酵过程，既是醛类物质被酵母大量还原的过程，也是乙酸苯乙酯、大马烯酮、γ-壬内酯等其它啤酒老化指示风味物质的生成过程。酵母还原醛类的能力与菌种特性有关，在大生产菌株一定的情况下，酵母的活力和生理状态等直接影响到其还原醛类的能力，并决定成品啤酒的氧化-还原势。笔者认为，在啤酒的新鲜度调控中，降低氧负荷、热负荷、过渡离子含量的同时，酵母的管理是又一调控核心。影响酵母活力的操作，都将影响到酵母的还原能力、产生内源抗氧化剂的能力以及酵母生成醇酯风味的能力。值得注意的是，如果酵母管理不当，甚至会造成酵母自溶，从而会因释放铁、铜离子等促氧化因子和脂肪酸等老化底物，加剧啤酒的老化。

3 结论

本研究利用本实验室开发的GC-MS检测方法，跟踪了大生产中18种与老化相关物质的变化过程，明确了其在酿造过程的变化趋势。结果表明，酵母具有较高的还原性，麦汁中的老化醛类物质在发酵初期即被大幅还原，发酵过程几乎不变，酵母的菌种活力对成品酒中的醛类物质的含量分布起到决定性作用。作为新鲜啤酒的代表风味物质乙酸苯乙酯，在发酵过程中大量生成;γ-壬内酯、大马烯酮是酵母代谢的产物，在发酵过程中亦有较大幅度的增加;而糠基乙醚等其它在检物质的变化无明显规律。本研究识别出酵母对啤酒老化指标的重要影响，明确了加强酵母管理的重要性，为大生产过程中新鲜度的调控提供了有力的支持。

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