广金钱草根瘤菌抗逆性和遗传多样性分析

谷 峻 ，张静苗，张碧瑶，马杏贤，李良冰，吴燕玲

(华南师范大学生命科学学院，广东广州510631)

广金钱草(Desmodium styracifolium)是豆科植物山蚂蝗属中的一种，其干燥地上部分为常用传统中药，收载于中华人民共和国药典［1］，其味甘、性凉、具有清热和利尿的功效，可用于治疗泌尿系统感染、尿路结石和胆石症等. 广金钱草主产于广东、广西、海南等地［1］. 近些年随着其疗效被确认，对广金钱草需求量逐年增加，使得其野生资源不断减少.也是目前中药材生产的主要方法. 随着广金钱草的连年种植，病害发生日益严重［2］. 迄今为止，国际上对重要的土传病害还没有十分有效的防治方法，然而伴随着土壤微生物分子生态学技术的发展，研究者提出利用土壤中的有益微生物种群与有害微生物的竞争、拮抗、捕食等生态学关系，使有益微生物类群占据有利的生态位，可能是控制土传病害的有效途径［3－5］.根瘤菌作为与豆科植物共生的一类有益微生物类群，一旦与宿主建立共生体后，能够为宿主提供生长必需的氮素营养，增加宿主的抗逆性.然而目前国内外对广金钱草根瘤菌的研究还未见报道.

筛选抗逆性强的根瘤菌菌株是获得优良的豆科植物－生物固氮共生体系的前提，本文研究了广金钱草根瘤菌对不同盐度、温度、酸碱度和重金属耐受性等生物学特性.BOX－PCR 是一项可靠的、相对稳定的基于基因组水平的指纹图谱分析手段，它是根据广泛存在于细菌基因组中的短重复序列(BOX)的保守性来设计引物并扩增位于重复序列间的不同片段，近年来被广泛地用于高效根瘤菌菌株的田间筛选标记［6－8］. 获得的结果能进一步明确广金钱草根瘤菌的系统发育地位和遗传多样性，本研究选取代表菌株测定了其recA 基因序列并进行系统发育分析.为进一步筛选与广金钱草共生的高效固氮体系，提高广金钱草的产量和品质提供优良的种质资源.

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

PCR 试剂及转化试剂均购自大连宝生物公司，Axygen 凝胶回收试剂盒和DNA 提取试剂盒分别购自谊桥生物科技公司及美津生物科技有限公司(广州). PTC100 PCR 扩增仪(MJ Research 公司，美国)，高速冷冻离心机Eppendorf 5417R (Eppendorf，美国). 本研究使用的引物由北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司合成，BOX－PCR 所用引物序列为5’－ CTACGGCAAGGCGACGCTGACG－3’［9］，recA 基 因 扩 增 引 物 为41F5’－ TTCGGCAAGGGMTCGRTSATG－ 3’，640R5’－ ACATSACRCCGATCTTCATGC－3’［10］.

1.2 供试菌株

采用土壤捕捉法获得根瘤，土壤为砖红壤，pH值5.5;在实验室条件下将获得的新鲜根瘤经体积分数为75%的乙醇表面消毒1 min，经质量分数为0.1%的氯化汞溶液浸泡1 min 后，无菌水冲洗3次，将根瘤切开后在YMA 平板上划线分离，于28～30 ℃培养7～10 d，将长出的根瘤菌经平板划线和显微镜镜检后，获得根瘤菌纯菌株并接种YMA 斜面培养后，4 ℃冰箱保藏备用. 将分离的菌株经活化后，收集新鲜菌体回接于经低氮培养液生长的广金钱草植株上，经结瘤试验确定为广金钱草根瘤菌.供试菌株及参比菌株见表1，其中慢生参比菌株由中国农业大学生物学院陈文新课题组馈赠.

本研究所用的广金钱草种子购买于广东南方中药材种苗基地.

表1 供试菌株一览表Table 1 The rhizobial strains used in this study

1.3 供试菌株的抗逆性测定

供试菌株经YMA 平板活化后，接种至各YMA供试平板上.耐盐试验NaCl 的终质量分数(下同)为1.0%～4.0%;pH 耐受试验分别为4、5、9、10、11.温度耐受性分别于4、10、40 ℃培养5～15 d，观察并记录结果;在YMA 培养基中分别添加重金属Zn2+，Cu2+，Pb2+，及Zn2+/ Pb2+的组合至终浓度为4 mmol/L，测定供试菌株对不同重金属的耐受性.接种后于28 ℃黑暗培养7～10 d、观察和记录菌株生长情况.

1.4 遗传多样性分析

1.4.1 总DNA 的提取 供试菌株经YMA 斜面活化后，接种于5 mL YMA 液体培养基中，28 ℃，180 r/min 摇床培养5～7 d，取1.5 mL 菌液于10 000 r/min 收集菌体，按照试剂盒说明书提取总DNA，用紫外分光光度计测定提取的DNA 浓度，使用前经稀释至50 ng/μL.

1.4.2 BOX－PCR 指纹图谱分析 PCR 扩增反应按文献［11］的要求加入PCR 反应各组分，按PCR循环程序进行扩增. 取8～10 μL PCR 产物经质量分数1.5%琼脂糖电泳确定扩增效果. 在凝胶成像仪中扫描凝胶，将指纹图谱用TIFF 文件保存. 图像信息利用GelcomparII(version 3.5)分析软件，采用平均连锁法(UPGMA)聚类，最后得到供试菌株和参比菌株的聚类树状图［12］.

1.4.3 recA 基因扩增及系统发育分析 recA 基因扩增程序:95 ℃3 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，35个循环，72 ℃5 min. 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物长度，经凝胶回收纯化后，与载体pMD18－T 连接，采用热激法转化到大肠杆菌DH5α中，采用蓝白斑法和PCR 法检测阳性克隆. 将获得的阳性克隆送至北京六合华大基因科技股份有限公司广州分部测序. 将测序获得recA 基因序列及Gen-Bank 中获得的根瘤菌参比菌株的相应基因序列经Clustal X 软件序列比对后，采用Mega4.0 软件中的邻接法(Neighbor－joining)进行系统发育树的构建，自展值(bootstrap)为1 000［12］.

2 结果与分析

2.1 根瘤菌对不同盐度、pH 和温度的耐受性

供试菌株均能够在含有质量分数(下同)为1%NaCl 的YMA 平板上生长，仅有2 株菌能够耐受2%NaCl，所有的供试菌在高于3%NaCl 的YMA 平板上无法生长(表2)，在pH 5 和pH 9 的条件下能够生长，pH 4 和pH 10 的YMA 上不能生长. 此外，供试菌株对不同温度表现出了不同的耐受性，分别有4株和10 株根瘤菌在4 ℃和10 ℃条件下能够生长，仅有1 株供试菌在40 ℃下生长.

表2 供试菌株在不同NaCl、pH 及温度下的生长情况Table 2 The growth of the tested strains in different NaCl、pH and temperatures

2.2 根瘤菌对不同重金属的耐受性

供试菌株对4 mmol/L 的Zn2+、Pb2+及Pb2+/Zn2+均有很好的耐受性(表3). 2 株广金钱草根瘤菌能够在含有4 mmol/L Cu2+的YMA 平板上生长.广金钱草根瘤菌菌株对重金属Pb2+、Zn2+的耐受性要强于Cu2+的耐受性.

表3 供试菌株对不同重金属的耐受性Table 3 The resistance of the tested strains to different heavy metals

2.3 广金钱草根瘤菌的BOX－PCR 指纹图谱分析

对14 株广金钱草根瘤菌和6 株慢生根瘤菌参比菌株进行了指纹图谱扩增和聚类分析(图1)，在79%的相似水平上，有12 株慢生广金钱草根瘤菌的BOX－PCR 指纹图谱与参比菌株埃氏慢生根瘤菌(B.elkanii)在90%的相似水平上聚类形成1个分支，表明与广金钱草共生的慢生根瘤菌在基因组水平上与埃氏慢生根瘤菌B.elkanii 更为相近.在91%的相似水平上该分支可分成3个亚分支，其中亚分支1 由5 株广金钱草慢生根瘤菌构成，亚分支2 由4株广金钱草根瘤菌和1 株参比菌株埃氏慢生根瘤菌B.elkanii 聚群，另有3 株慢生根瘤菌构成亚分支3.而其余2 株广金钱草根瘤菌未与已知的参比菌株聚在一起.

图1 广金钱草根瘤菌BOX－PCR 指纹图谱聚类分析Figure 1 The cluster analysis of BOX－PCR fingerprinting for the rhizobia nodulated with D. styracifolium

2.4 基于recA 基因的系统发育分析

recA 基因编码细菌DNA 重组蛋白的α 亚基，与细菌修复系统发挥功能相关. 由于该基因编码的蛋白功能相对保守，被用于慢生根瘤菌系统发育研究中.作者在BOX－PCR 指纹图谱分析基础上，选取各亚分支的代表菌株进行recA 基因的克隆和测序，测序后得到的基因序列长度均大于500 bp，采用邻接法构建系统发育树(图2).

测序的供试9 株代表菌株中，共有8 株菌位于B.elkanii 和B.pachyrhizi 构成的系统发育分支上，其中3 株慢生根瘤菌SCNU2、SCNU5 和SCNU6 位于B.elkanii 系统发育亚分支上，菌株SCNU2 和SCNU5的序列同源性为100%，慢生根瘤菌SCNU4、SCNU7和SCNU13 位于B. pachyrhizi 系统发育亚分支上;慢生根瘤菌SCNU3 和SCNU9 虽然位于B.elkanii 和B. pachyrhizi 构成的系统发育发育分支上，但各自成为1个独立的亚分支;仅有1 株菌位于快生型根瘤菌的系统发育分支上，与已知种Rhizobium leguminosarum USDA2671T序列同源性高，约为90%.

图2 以recA 基因部分序列构建的广金钱草根瘤菌系统发育树Figure 2 Phylogenetic tree of recA gene showing the relationships among therhizobial isolates from Desmodium styacifolium and the related species

3 讨论

近年来，随着广金钱草规范化种植基地的建立，已经对广金钱草种植中的种质资源、生物学特性、种植技术、田间管理及药材质量评价等问题开展研究，并制定出了规范化生产标准操作规程［13－15］. 然而，与广金钱草共生的根瘤菌对宿主在生长过程中及最终药材品质的影响几乎未有涉及，并且对广金钱草根瘤菌的资源也未见报道. 笔者之前的研究发现，分布于我国不同地区的山蚂蝗属豆科植物的根瘤菌主要以慢生根瘤菌为主，其中埃氏慢生根瘤菌为优势种群［12］.前期的研究未涉及宿主山蚂蝗属中的广金钱草根瘤菌的资源状况.本研究结果发现，在华南地区的砖红壤中与广金钱草共生的根瘤菌也多与埃氏慢生根瘤菌亲缘关系近，recA 基因构建的系统发育树中，3 株慢生根瘤菌位于埃氏慢生根瘤菌的系统发育分支，另有2 株处于独立的系统发育分支，可能代表新的慢生根瘤菌种群，需要进一步扩大种群来确定.

与分离自其它宿主豆科植物的根瘤菌相比，本研究分离到的广金钱草根瘤菌对盐的耐受性普遍较弱，这一结果与分离自不同地区山蚂蝗属其它种宿主植物的根瘤菌耐盐性一致［16－17］. 徐开未等［16］研究分离自金沙江干热河谷区的山蚂蝗属根瘤菌抗逆性时发现，山蚂蝗属根瘤菌有较强的抗低温和抗热的能力;本研究表明广金钱草根瘤菌对低温的耐受性较强而对高温的耐受性弱，仅1 株菌能够在40 ℃生长，其它根瘤菌均无法耐受40 ℃. 重金属耐性分析表明，广金钱草根瘤菌对不同重金属有良好的耐受性和抗性，并且对锌、铅单盐和其双盐在4 mmol/L 下都有很好的耐受性，这与缪福俊等［17］的研究结果较一致.

此外，本研究采用了BOX－PCR 技术对广金钱草根瘤菌的遗传多样性进行分析，一方面揭示了广金钱草根瘤菌在基因组水平上的多样性，同时也为下一步田间筛选高效生物固氮体系提供了依据. 由于本研究中分离到的广金钱草根瘤菌绝大多数为慢生型，而慢生根瘤菌的16S rDNA 基因序列相似性很高，很难很好的将不同种慢生根瘤菌区分开［18］，因此采用了recA 基因序列分析技术对获得的广金钱草根瘤菌进行系统发育分析.BOX－PCR 分析发现供试的14 株菌中有12 株菌在基因组水平上与埃氏慢生根瘤菌相似，而recA 基因序列系统发育分析将在BOX－PCR 分析中聚群的菌株区分开.已有报道认为BOX－PCR 不适用于种群划分及种属的界定［8］，本研究结果表明BOX－PCR 技术对慢生根瘤菌不同种群的划分结果与recA 基因序列分析获得的结果较一致. 这可能与作者采用土壤捕捉法获得慢生根瘤菌有关，及分析的种群数量较少造成的，需要进一步扩大种群数量来比较分析.

致谢:感谢华南师范大学生命科学学院冯启理教授提供仪器以及中国农业大学生物学院陈文峰副教授帮助聚类分析.

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］. 北京:化学工业出版社，2005:30.

［2］王利国，王晓英，翁伟华，等. 广金钱草根腐病病原生物学特性研究［J］. 中华中医药学刊，2008，26(1):147－149.

［3］DOBBELAERE S，VANDERLEYDEN J，OKON Y.Plant growth－promoting effects of diazotrophs in the rhizosphere［J］. Crit Rev Plant Sci，2003，22:107－149.

［4］DUFFY B，KEEL C，DEFAGO G. Potential role of pathogen signaling in multitrophic plant－microbe interactions involved in disease protection［J］. Appl Environ Microbiol，2004，70:1836－1842.

［5］HJORT K，LEMBKE A，SPEKSNIJDER A，et al. Community structure of actively growing bacterial populations in plant pathogen suppressive soil［J］.Microbiol Ecology，2007，53:399－413.

［6］JIA R Z，GU J，TIAN C F，et al. Screening of high effective alfalfa rhizobial strains with a comprehensive protocol［J］. Annals of Microbiology，2008，58:731－739.

［7］肖猛，刘晓云，刘桂霞，等. BOX－PCR 分子标记对补播紫花苜蓿供试根瘤菌田间竞争结瘤能力的研究［J］. 华北农学报，2011，26(1):187－190.

［8］BINDE D R，MENNA P，BANGEL E V，et al. Rep－PCR fingerprinting and taxonomy based on the sequencing of the 16S rRNA gene of 54 elite commercial rhizobial strains［J］. Appl Microbiol Biotechnol，2009，83:897－908.

［9］VERSALOVIC J M，SCHMEIDER F J，DE BUI J，et al.Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence－based polymerase chain reaction［J］. Methods in Molecular and Cellular Biology，1994，5:25－40.

［10］VINUESA P，SILVA C，LORITE M J，et al. Molecular systematics of rhizobia based on maximum likelihood and Bayesian phylogenies inferred from rrs，atpD，recA and nifH sequences，and their use in the classification of Sesbania microsymbionts from Venezuelan wetlands［J］. Syst Appl Microbiol，2005，28:702－716.

［11］高俊莲，陈文新，TEREFEWORK Z，et al. 斜茎黄芪根瘤菌的16S rDNA 和23S rDNA PCR－RFLP 比较分析［J］. 微生物学通报，1999，26:120－125.

［12］谷峻，张静苗，贾瑞宗，等.山蚂蝗慢生根瘤菌的遗传多样性及系统发育分析［J］. 微生物学报，2011，51(10):1310－1317.

［13］陈丰连，张文进，徐鸿华. 广金钱草田间育苗影响因素研究［J］. 广州中医药大学学报，2010，27(3):282－284.

［14］周佳民，尹小红，陈超君，等. 施氮水平对广金钱草产量和活性成分含量的影响［J］. 中国中药杂志，2010，35(12):1533－1536.

［15］陈丰连，张文进，徐鸿华. 广金钱草适宜采收期研究［J］. 中药材，2010，33(2):178－180.

［16］徐开未，张小平，陈远学，等. 金沙江干热河谷区山蚂蝗属根瘤菌抗逆性研究［J］. 安徽农业科学，2009，37(2):501－503.

［17］缪福俊，熊智，孙浩，等. 兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌耐受性研究［J］. 安徽农业科学，2010，38(21):11365－11367.

［18］RIVAS R，MARTENS M，DE LAJUDIE P，et al. Multilocus sequence analysis of the genus Bradyrhizobium［J］. Syst Appl Microbiol，2009，32:101－110.