亚洲主要流行HIV-1 Gp120及其5个高变区多态性分析

董万强， 姚 能， 徐庆刚

(江苏大学生命科学研究院， 镇江 212013)

由于HIV-1的逆转录酶没有转录校正能力，因此HIV-1基因具有很高的变异性。根据基因的不同，HIV-1分为M(主要组)、N(非M非O组)、O(外围组)和P 4个组。其中，M组是导致全球艾滋病流行的主要组群[2]，其又可以进一步分为11个亚型(包括A1、A2、B、C、D、F1、F2、G、H、J和K)，49个流行重组型(CRFs)和超过200个唯一重组型(URFs)。在亚洲流行的亚型主要有B′、C、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC。高变异性使得HIV-1能够轻易地逃逸宿主免疫反应和药物压力[3-5]。

Env 基因编码表面膜蛋白Gp120和跨膜蛋白Gp41，在HIV-1基因组中突变率最高。Gp120不仅是病毒侵入宿主并与宿主细胞受体(CD4和CCR5或CXCR4)的结合位点，而且是宿主免疫反应的主要靶标[6-9]。Gp120包含5个高变区(V1-V5)和4个相对保守的区域(C1-C4)[10]。在5个高变区中，V3区包含大约35个氨基酸并由2个半胱氨酸形成环形结构连接。V3区直接决定病毒辅助受体类型(即细胞嗜性)[11-13]。而V1/V2和V4区，也会影响病毒辅助受体使用情况[14-16]。

同时，这几个高变区也是中和抗体的重要靶点。V1/V2区的高变性增强了HIV-1逃逸免疫的能力[15,17-18]。V4和V5区参与CD4结合和自体免疫[19-20]。更重要的是，V1-V5区结构和功能的共同作用最大程度上加强了HIV-1病毒逃逸免疫的能力[5]。最新研究表明V1/V2区长度多态性是B亚型HIV-1流行的主要原因，增加V1/V2区的长度能够提高B亚型病毒抵抗宿主免疫能力[21]。这些研究都表明HIV-1 Gp120的多态性和序列特征，尤其是5个高变区，在HIV-1发病机理和免疫逃逸中起到至关重要的作用。直接影响HIV-1疫苗研究的发展。

在本文中，我们下载了现有数据库中记载的包括B′、C、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC 5种亚洲主要流行亚型的所有Gp120及其5个高变区序列，分析了HIV-1 Gp120及其5个高变区序列的长度多态性，糖基化位点数以及序列特征。发现V3区表现出了最低的长度多态性，最少的糖基化位点；V1和V4区长度多态性较高，糖基化位点也较高。HIV-1 Gp120 高变区多态性的研究将为艾滋病疫苗的发展提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 序列收集和排序

从Los Alamos国家实验室(Los Alamos National Laboratory, LANL)的HIV序列数据库(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html)下载了亚洲所有 HIV-1 Gp120 及其5个高变区序列，合计为19373条(包括亚型B′、C、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC)。这些序列按所属区域和亚型的不同被分成30个序列群(见表1)。

表1 每个序列群的序列数目

表中每一个数字代表HIV-1特定亚型或重组型(B′、C、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC)的特定区域(Gp120、V1、V2、V3、V4和V5)的序列数量。

1.2 长度多态性和序列特征分析

将表1中序列群转换成蛋白序列后，我们统计了每条序列的长度。使用MEGA4.0.2软件中的Clustal W程序，比较了每个序列群的序列特征，包括每个位点特定氨基酸出现的频率，然后根据每个位点出现频率最高的氨基酸使用WEBLOGO软件(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)做了序列logo图[22]。另外，由于V3区决定了HIV-1的辅助受体嗜性，所以我们对6个不同亚型的V3区一致序列进行了比对，并使用HIV-1 PhenoPred(http://yjxy.ujs.edu.cn/R5-X4%20pred.rar)软件预测了各一致序列的辅助受体嗜性[23]。

1.3 潜在糖基化位点分析

基于一个三肽Asn-Xaa-Ser/Thr预测为一个糖基化位点的原则，我们编写了一个小的程序用来统计所研究序列中的糖基化位点数量。其中，每条过短或者过长的序列均被删除。

2 结果

2.1 Gp120的长度多态性分析

图1A中展示了HIV-1不同亚型中Gp120的长度多态性。亚型B′、C、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC的Gp120有不同的长度大小，分别为491～534、491～529、496～539、494～521和506～514个氨基酸。其中，CRF08_BC的100%序列长度大小均集中在506～515个氨基酸的范围内，表明它们的多态性较低。其它亚型则分布在更大的长度范围内。B′亚型75.96%和C亚型76.65%的序列分布在501～520个氨基酸范围内。CRF01_AE的91.2%和CRF07_BC的94.49%分布在496～515个氨基酸的范围内。所以，在以上5种亚型和重组型中，B′和C有较高的Gp120长度多态性，而CRF08_BC多态性相对较低(图1A)。

2.2 Gp120 5个高变区的长度多态性分析

图1B-F描述了Gp120 5个高变区的长度多态性特征。V1-V5的平均长度大小分别为29(14～44)、43(31～57)、34(30～38)、31(18～44)和15(8～23)个氨基酸。除V3区外，不同亚型的其它高变区具有非常相似的长度多态性。而大多数的的V3环(B′中88.3%、C中98.2%、CRF01_AE中96.7%、CRF07_BC中99.1%和CRF08_BC中100%)均有35个氨基酸。5个高变区的长度分布表明V1、V2、V4和V5区具有更高的长度多态性，而V3区在长度上最保守(图1B-F)。这也许是因为V3环对HIV-1感染和发病机制的重要性造成的。

图1 亚洲主要流行亚型HIV-1 Gp120和V1-V5区长度多态性分析

A—Gp120；B—V1区；C—V2区；D—V3区；E—V4区；F—V5区。

进一步对5种HIV-1亚型和重组型的V3区一致序列分析发现，除B′的13号位点(R/H)、18号位点(Q/R)和19号位点(T/A)的突变，以及CRF01_AE的5号位点(N/S)、10号位点(K/T)、13号位点(R/T)、19号位点(T/V)和22号位点(A/R)的突变外，它们有几乎完全一致的序列(图2)。验证了V3环的保守。已有研究表明V3区的11和25号位点的氨基酸从中性和/或酸性氨基酸到碱性氨基酸的转变决定了HIV-1的辅助受体嗜性。本文用生物信息学软件R5/X4-pred对这6个亚型的V3区一致序列的辅助受体嗜性进行了分析[23]，分析结果显示所有亚型和重组型均为R5嗜性。这不仅证实了我们以前研究的结论即大部分的亚型B′和C序列均属于R5嗜性的观点[24]，也反映出R5型菌株在HIV-1传播和发病机理上占有非常关键的地位[25-26]。

图2不同亚型V3区一致序列比对

其中“↑”表示决定HIV-1辅助受体嗜性的2个关键位点。每条一致序列的辅助受体嗜性均用“HIV-1PhenoPred”软件预测。

2.3 Gp120 5个高变区的潜在糖基化位点(PNGS)分析

HIV-1的Gp120是一个高糖基化蛋白，糖基化不仅仅参与Gp120的产生和形成，也参与Gp120免疫原性的降低，从而减少抗体中和反应。本文对Gp120 5个高变区的潜在糖基化位点进行了统计分析，分析发现，5个高变区的潜在糖基化位点数不同(图3A-E)。其中，86.5%～98.2%的V4区含有3～6个潜在糖基化位点，在5个高变区中数量最多(图3D)，而79.1%～96.1%的V3区只有1个潜在糖基化位点，在5个高变区中数量最少(图3C)。另外，90.9%～97.5%的V5区含1～2个潜在糖基化位点(图3E)，稍多于V3区。82.5%～100%的V1区和86.3%～100%的V2区含有2～4个潜在糖基化位点(图3A和B)，比V4区要少。

图3 HIV-1亚洲主要流行亚型的Gp120 V1-V5区中潜在糖基化位点数量分布图

A—V1区；B—V2区；C—V3区；D—V4区；E—V5区。

2.4 Gp120 5个高变区的序列特征分析

为了描述V1-V5区的序列特征，我们绘制了每个高变区的序列LOGO图。在每个高变区中，不同亚型不仅具有相似的保守序列，也有一些高度变化的序列(图4)。这些高变区也许是不同亚型的遗传变异导致的，显示了与亚型相关的序列特征。尤其是V1和V4区比其他区变异更多，可能与这两个区对HIV-1免疫逃避的重要性有关。V3区是最保守的高变区，与长度多态性的分析一致(图1)。几乎所有的V3区中都有“GPGQ/R”基序。在V2和V5区，也分别发现同样保守的基序“ALFY”和“ETFRP”。这些保守基序可能需要保持恒定从而正常发挥它们非常重要的功能。

图4 亚洲主要流行亚型HIV-1 V1-V5区Logo图

A—V1区；B—V2区；C—V3区；D—V4区；E—V5区。

3 讨论

HIV-1 Gp120蛋白位于病毒表面，对病毒侵入宿主细胞起决定作用[11]。它是中和抗体的最重要的靶点[6-9]。Gp120的高度变异和高糖基化位点拥有率能通过不断地改变抗原决定表位和降低抗原性增加AIDS疫苗研究的难度[5]。通过分析亚洲主要流行亚型的HIV-1 Gp120序列，我们发现大部分的HIV-1 Gp120含有496～515个氨基酸(图1A)。这表明具有496～515个氨基酸长度的HIV-1 Gp120的毒株有助于疫苗研究。

在Gp120包含的5个高变区中，V3区是高度保守的区域，反映其功能的重要性[21,27]。首先，V3环是决定HIV-1细胞嗜性最重要的区域[26]，其次，V3环几乎没有糖基化位点，能更容易结合辅助受体(CCR5或者CXCR4)。在HIV-1感染的早期，甚至整个感染过程中，通常都是R5型毒株[28-29]，随着病程的进展，免疫系统崩溃，R5型也转变为X4型[25,30-31]。本研究中发现，所有亚型和重组型的V3环序列均表现为R5嗜性(图2)，表明R5型毒株在HIV-1生命周期中占有主导地位[24]。 如果能够研制出抑制CCR5的药物，将真正有效地治疗艾滋病患者，所以，R5型毒株应该被优先用于AIDS疫苗的研究。

V1/V2、V4和V5区位于V3区的外层，是最容易受免疫攻击的区域[19]。V1/V2、V4和V5区已经被证明在病毒对自体中和反应中起作用[32]。为抵抗免疫选择，HIV-1的V1和V4区的确经历了多样化的选择压力[33]。我们的分析也发现V1和V4区有高度的长度多态性、异质性和较多的糖基化位点，而V2和V5区的长度多态性、异质性较低，糖基化位点也较少(图1、3和4)。这4个高变区的长度多态性、异质性和糖基化位点不仅促成了病毒的免疫逃逸，同时也保护V3区使其免受免疫攻击[21]。所以，通过一些策略来降低这4个高变区的长度多态性、异质性和糖基化位点数量可能是艾滋病疫苗发展的具有广泛前景的新方向。

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