细节对高效液相色谱法检测结果准确性的探讨

花素静，杨 铭，梁 军

(1.郑州市兽药饲料监察所，河南 郑州 450002; 2.商丘职业技术学院 生物工程系，河南 商丘 476000)

高效液相色谱法(high performance liquid chromatographu,HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等.高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析.该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术[1]36-38.

高效液相色谱法具有分离效果好、灵敏度高、应用范围广、分析速度快等优点.在进样量为μL数量级的情况下，常规紫外检测器的灵敏度可达0.01ng，并可以分析70%以上的有机化合物.大多数样品在30 min内可完成分析，甚至有些样品在5min内即可完成分析.此外，高效液相色谱法还具有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点.但进行高效液相色谱分析时，从样品处理到上机，每一个细节都要处理得当，否则，就会造成分析结果相对偏差较大.依据行业标准，含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次，由全部结果(n>=4)求得平均值，相对标准偏差(RSD)一般应不大于1.5%[2]3. 本文以注射用青霉素钾为试验样品，操作严格依据2010年版《中华人民共和国兽药典》一部标准[3]3，通过两台高效液相色谱仪间的比对试验，详细分析说明该问题.

1 材料和方法

1.1 仪器

BP211d十万分之一天平，北京塞多利斯天平有限公司.

1100高效液相色谱仪/VWD检测器，安捷伦科技有限公司，配Aglient HC-C18(2)柱.

1200高效液相色谱仪/VWD检测器，安捷伦科技有限公司，配Eclipse XDB-C18柱.

1.2 试剂

青霉素对照品(K0251206，92.7%，中国兽医药品监察所)；注射用青霉素钾(2.5 g∶400万单位)；乙腈(HPLC级)；无水磷酸二氢钾(优级纯)；超纯水.

1.3 检验方法

1.3.1 色谱条件

流动相：0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液∶乙腈(70∶30，用磷酸调pH至2.5)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：225 nm；柱温：26 ℃.

1.3.2 处理步骤

1.3.2.1 溶液配制

标准品溶液：精密称取青霉素对照品0.05 g两份分别至100 mL容量瓶，各加少许超纯水，轻摇使标准品充分溶解，继续加入高纯水至刻度线附近，用一次性滴管定容至刻度，上下振摇量瓶使充分混匀，得两份终浓度为0.5 mg/mL的标准溶液.

样品溶液：精密称取注射用青霉素钾样品0.05 g两份分别至100 mL容量瓶，各加少许超纯水，轻摇使标准品充分溶解，继续加入高纯水至刻度线附近，用一次性滴管定容至刻度，上下振摇量瓶使充分混匀，得两份终浓度为0.5 mg/mL的样品溶液.

1.3.2.2 过滤与上机

标准品溶液：取规格为1 mL的一次性注射器，从一份标准品溶液中吸取1 mL，直接分别注入两个样品瓶中，每个样品瓶中约0.5 mL溶液，拧紧瓶盖，将两瓶标准品溶液分别在两台高效液相色谱仪上按照色谱条件进行检测，另一份标准品溶液同上分别注入两个样品瓶中，分别在两台高效液相色谱仪上按照色谱条件进行检测.

样品溶液：取规格为1 mL的一次性注射器，从一份样品溶液中吸取1mL，通过一个针筒式滤膜过滤器，连续分别过滤至两个样品瓶中，每个样品瓶中约0.5 mL溶液，拧紧瓶盖，将两瓶样品溶液分别在两台高效液相色谱仪上按照色谱条件进行检测，另一份样品溶液同上分别注入两个样品瓶中，分别在两台高效液相色谱仪上按照色谱条件进行检测.

2 结果

测试结果如图1、2.

图1 Aglient 1100图谱

图2 Aglient 1200图谱

依据两台高效液相色谱仪显示主要参数结果计算检测样品含量，按外标法以峰面积计算，公式如下:

A——试样溶液对应的色谱峰面积响应值；Ms——标准品质量(g)；

Cs——青霉素标准品的纯度(%)；D——试样稀释倍数；

As——青霉素标准溶液对应的色谱峰面积响应值；M——试样质量(g)；

Ds——青霉素标准品稀释倍数；平均装量——经检测，其值为2.5077 g.

每台仪器检测含量结果取两样平均值，结果如表1所示.

表1 两台高效液相色谱仪检测参数及计算含量结果

通过检测结果及计算发现两台仪器的检测结果相对偏差较大(为1.8%).

3 原因分析

3.1 青霉素标准品及样品分解因素

药物中青霉素检测的处理方法简单，故开始便在青霉素标准品及样品分解上找原因.一直认为青霉素标准品及样品易分解，如在配制时间不一致、不同时间进样，可能会因标准品及样品的分解程度不一而导致检测结果相对偏差过大.后通过同时配制标准品、同时配制样品、同时进样，并将其中1瓶标准品在4个小时内进样6次，发现青霉素基本未分解，结果比第一次略好一些，但是差别非常小，通过检测结果分析发现相对偏差仍然较大(为1.6%)，相关图谱及数据见图3及表2所示，故而排除青霉素分解的因素.

图3 同一瓶对照品四个小时内所有图谱的叠加图谱

3.2 仪器间的影响

排除青霉素标准品及样品分解因素影响后，我们怀疑仪器间的相对偏差.但通过将一台仪器上的同一瓶标准品、同一瓶样品在另一台仪器上进样，计算结果显示，相对偏差在可控范围内(0.11%)，说明并不是仪器的原因,方法如上述外标法计算，具体数值如下表3所示.

表2 同一瓶对照品四个小时内峰面积响应值

表3 两台高效液相色谱仪检测参数及计算含量结果

3.3 一次性注射器及一次性滤膜过滤器吸附效应的影响

在排除青霉素标准品及样品分解因素、仪器间的影响因素后，我们开始在样品处理步骤上找原因.思前虑后，比较所有样品瓶间的处理，我们认定整个样品处理过程只是在过滤环节有所不同，具体来说就是我们用注射器及滤膜过滤的样品先装一进样瓶后，又用同一注射器及同一滤膜过滤再次过滤样品分装于另一进样瓶.通过查阅相关资料得知，一方面因为本实验使用的一次性注射器及滤膜过滤器，其材质为塑料及有机系尼龙，吸附能力非常强，吸附了溶液中的溶质，另一方面相当于第一次过滤时注射器及滤膜没浸润，而第二次过滤时相当于已浸润.因此，即使用同一注射器及同一滤膜过滤同一样品时，其吸附及浸润(稀释)因素对结果可能影响很大.

4 改进措施

针对上述可能导致结果相对偏差过大因素，重新称量青霉素对照品与样品，重新同时溶解、定容对照品与样品溶液，用1mL一次性注射器吸取溶液，通过一个一次性滤膜装入一个样品瓶中后，换注射器与滤膜，继续装瓶，每个样品瓶中的溶液体积约为1mL.同时在两台高效液相色谱仪上进行检测.

5 改进后结果

经过改进后，两台高效液相色谱仪检测到的含量相对偏差在可控范围内(0.13%)，结果如表4所示，有明显改善.

表4 两台高效液相色谱仪检测参数及计算含量结果

6 结论

第一，由于青霉素水溶液的半衰期短，因此在做青霉素类药物检测时，对照品溶液及样品溶液最好现配现用、同步进行处理，才可以从根本上保证检测结果的准确性.

第二，对于高效液相色谱的紫外检测器，其氘灯能量与使用时间有很大关系，如果氘灯使用时间超出使用寿命，其能量可能不足，从而对检测结果的正确性带来不确定因素.

第三，样品处理过程中的细节问题必须考虑.本文出现的问题，其实是很小的细节问题，但其对检测结果的影响却是很大的.一次性注射器及尼龙针筒式滤膜过滤器，适用范围广，可应用于绝大多数有机溶液及无机溶液的过滤.由于塑料及尼龙滤膜对溶质的吸附(稀释)作用现在还没有较全面的资料介绍，故而在日常的含量检测中，必须取相同体积的标准品溶液与样品溶液通过滤膜过滤器.本文试验证明，就是这个貌似不起眼的细节，大大影响了检验数据的真实性与准确性.

[1] 高效液相色谱法[J].北方园艺,2012(21).

[2] 兽药检验操作规程[S].中国兽医药品监察所,2005.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国兽药典(一部)[M].北京：中国农业出版社,2011.