雌激素缺乏导致的骨质疏松发病过程中骨髓间充质干细胞FasL 表达降低对CD4 +T 淋巴细胞凋亡的影响*

邵秉一， 于 洋， 付 欣， 廖 立， 杨德琴△， 金 岩

(1重庆医科大学附属口腔医院，2重庆市口腔疾病与生物医学研究中心，重庆400015;3 第四军医大学口腔医学院口腔组织病理学教研室，陕西 西安710032)

骨质疏松是一种骨密度降低、骨脆性增加、骨板结构紊乱、易发骨折的全身代谢性疾病［1］。绝经后骨质疏松是其中最为常见的一种类型。妇女绝经后，体内雌激素水平下降，能够激活T 淋巴细胞并释放多种细胞因子，如活化的CD4+T 淋巴细胞能分泌肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、γ 干扰素(interferon-γ INF-γ)、核因子κB 受体活化因子配体等重要的促破骨细胞生长的炎症因子，导致骨密度降低［2-4］。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是存在于骨髓中的多能干细胞，其具有的免疫调节功能在骨骼的发育与改建中发挥着重要的作用。BMMSCs 能抑制机体多种重要免疫细胞的增殖，如T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和NK 细胞［5-6］。Mazar 等［7］发现BMMSCs 在体外能通过细胞凋亡膜分子受体(Fas/FasL)信号途径诱导活化的T 淋巴细胞凋亡以躲避免疫系统的攻击。Kentaro 等［8］发现在体内注射的异种BMMSCs 能通过Fas/FasL 诱导淋巴细胞凋亡引起免疫耐受。这些实验证明了BMMSCs 能表达FasL，介导T 淋巴细胞凋亡。FasL 作为凋亡通路的配体在某些细胞中能够受到雌激素的调控。已报道的研究显示，雌激素缺乏能下调成骨细胞及破骨细胞自身的FasL 表达水平导致破骨细胞凋亡受到抑制［9-10］。但是雌激素是否能影响BMMSCs 中FasL 的表达导致T 淋巴细胞凋亡的改变，目前仍不清楚。本研究假设在雌激素缺乏导致的骨质疏松发生过程中，CD4+T 淋巴细胞的凋亡发生了改变，这可能是由于骨髓中的BMMSCs 对T 淋巴细胞的致凋亡作用发生了变化。实验通过构建骨质疏松模型及体外雌激素刺激观察雌激素对BMMSCs FasL 表达的改变及其对CD4+T 淋巴细胞凋亡的影响，进一步探讨绝经后骨质疏松的发病机制。

材 料 和 方 法

1 动物

取健康8 周龄BALB/c 雌性小鼠(第四军医大学实验动物中心提供)，随机选取20 只行双侧卵巢切除(ovariectomy，OVX):1%戊巴比妥纳腹腔麻醉，从背部开口完整摘除双侧卵巢。另选20 只假手术(sham)组在双侧腹下区取少量脂肪组织后止血缝合。置于SPF级动物房饲养2 个月，进行股骨micro-CT 扫描验证模型是否建立成功。

2 主要试剂和仪器

α-MEM 培养基和胰蛋白酶(Gibco);胎牛血清(四季青);无酚红的α-MEM 培养基(Gibco);17β-雌二醇(17β-estradiol，E2;Tocris);活性炭血清(Biowest);红细胞裂解液(碧云天);anti-mouse CD4 APC(Ebioscience);CD3 (BD Pharmingen);CD28 (BD Pharmingen);抗FasL 抗体(Santa Cruz);细胞总RNA提取试剂盒和一步法RT-PCR 试剂盒(TaKaRa);体式显微镜、倒置相差显微镜以及照相系统(Olympus);流式细胞分析仪(Beckmen Coulter);real-time PCR 仪(Applied Biosystems);micro-CT (GE)。

3 小鼠骨髓间充质干细胞原代培养及纯化

取BALB/c 小鼠断颈处死，乙醇浸泡5 min，超净台内无菌分离其胫骨和股骨，用完全培养基冲刷出全骨骨髓，轻柔吹打冲洗液制成单细胞悬液，加30 mL α-MEM(含20%FBS)平分至3 个9 cm 培养皿，培养24 h后弃去未贴壁细胞以后每3 d 换液1 次，待细胞生长达80%时进行传代。

4 流式细胞术鉴定BMMSCs 的表型分子

取筛选培养的第3 代细胞，PBS 冲洗2 遍，用3 mL/L 胰蛋白酶2 mL 消化1 min，α-MEM 中和消化，800 r/min 离心5 min，弃上清，用含3%FBS 的PBS 缓冲液制成单细胞悬液，调整细胞密度为2×105/L 后分装于Eppendorf 管中，每管200 μL，室温避光下分别加入不同标记的抗体:CD44、CD105、CD45(PE 标记)和CD29(FITC 标记)，4 ℃避光孵育1 h，流式细胞仪分析荧光细胞，专用配套软件计算细胞表面抗原阳性率，单位用%表示。

5 体外雌激素刺激BMMSCs

称取1 mg E2加50 μL 无水乙醇溶解，配制成保存液浓度，细胞在雌激素刺激前用PBS 冲洗2 遍后改用无酚红的α-MEM 培养(含10%活性炭血清)培养。待细胞生长至70%～80%，分别用0、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L 和100 nmol/L E2刺激24 h 后待用。

6 T 淋巴细胞与小鼠骨髓间充质细胞共培养

取4 ～8 周C57BL/6J 小鼠，断颈处死，乙醇浸泡5 min，在超净台内无菌摘取脾脏，将小鼠脾脏剪碎后混于Hanks 液中，400 目网滤过离心洗涤，加入RPMI-1640培养液(含10%FBS)，按每孔1 ×105个接种于24孔板中，24 孔板预先用CD3(5 mg/L)包埋4 h 后去除。每孔加入CD28(2 mg/L)激活3 d 后，再加入1 ×104BMMSCs(去势组、假手术组及BMMSC 加雌激素处理组)与T 淋巴细胞共培养3 d。

7 检测共培养体系中CD4+T 淋巴细胞凋亡

细胞共培养3 d 后，取上层液，1 000 r/min 离心5 min，收集细胞，加含3%FBS 的PBS 洗涤重悬，调整至1 ×109/L，加anti-mouse CD4 APC 4 ℃避光孵育1 h 后加入5 μL Annexin V 和5 μL 7-氨基放线菌素D (7-aminoactinomycin D，7-AAD)25 ℃避光孵育15 min，上机检测。

8 Real-time PCR 检测FasL mRNA 表达

分别收集去势组、假手术组及雌激素处理组细胞，用总RNA 提取试剂盒一步法提取细胞总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，β-actin 为内参照。参照GenBank 数据库，采用Primer 5.0 计算机软件设计引物，由TaKaRa 公司合成基因序列:β-actin 上游引物5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’;FasL 上 游 引 物5’-ATTGGCACCATCTTTACTGTTACC-3’，下 游 引 物5’-CTCCTTAGAATCTGTTTGCTCTCATA-3’。RT-PCR体系:Premix 10 μL，Dye 0.4 μL，ddH2O 6.6 μL，上、下游引物各0.5 μL，样本模板2 μL。反应条件参照产品说明。

9 Western blotting 检测FasL 蛋白的表达

取去势组、假手术组及不同浓度雌激素刺激组的细胞，采用碧云天全蛋白提取试剂盒进行全蛋白提取，用Bradford 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量测定;SDS-PAGE 电泳，转膜，封闭，免疫反应，最后进行化学发光反应，分析FasL 蛋白水平在各组间表达的差异。

10 统计学处理

实验重复3 次以上，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，测得的数据采用SPSS 11.0 软件进行统计分析，两组间均数比较采有t 检验，多组间均数比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t 检验，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Micro-CT 扫描比较股骨干骺端形态学参数

OVX 组与sham 组股骨干骺端形态学参数比较，骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)、骨表面积体积比(bone surface area/bone volume，BS/BV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁数量(trabecular number，Tb. N)、骨小梁分离度(trabecular spacing，Tb. Sp)和骨密度(bone mineral density，BMD)差异均有统计学意义(P ＜0.05)，表明卵巢摘除后的小鼠骨质疏松模型构建成功，见图1、表1。

Figure 1. Metaphyseal 3D reconstruction of sham mice (A)and OVX mice (B).图1 Sham 组与OVX 组股骨干骺端三维重建

表1 Sham 组和OVX 组股骨干骺端形态学参数比较Table 1. Metaphyseal morphological parameters in sham group and OVX group(mean±SD.n=6)

2 BMMSCs 的分离及纯化

第3 代细胞形态单一均匀大多呈梭形，少数为椭圆形，胞体较小，胞浆丰满，呈漩涡状生长，见图2。

Figure 2. The third generation of bone marrow mesenchymal stem cells. A:sham group;B:OVX group.图2 第3 代骨髓间充质干细胞

3 细胞表面分子鉴定

Sham 组CD44、CD105 和CD29 阳性率分别为97.6%、79.6%和97.8%，CD45 的阳性率为2.3%。OVX 组CD44、CD105 和CD29 阳性率分别为97.6%、74.3%和97.3%，CD45 的阳性率为2.9%。结果表明sham 组和OVX 组细胞都为BMMSCs，见图3。

4 Annexin V/7-AAD/CD4 三标染色检测共培养体系中CD4+T 淋巴细胞凋亡结果

Annexin V 能特异性标记凋亡早期细胞和坏死细胞。7-AAD 能染凋亡晚期细胞及坏死细胞。Antimouse CD4 特异性标记CD4+T 淋巴细胞。在流式图中左下象限为活细胞，右上象限为凋亡晚期细胞，右下象限为凋亡早期细胞，见图4。CD4+T 淋巴细胞凋亡程度比较:sham+雌激素组CD4+T 淋巴细胞凋亡程度较sham 组显著升高(P ＜0.05)，OVX 组CD4+T 淋巴细胞凋亡程度较sham 组明显降低(P ＜0.05)，见图4。

Figure 3. Phenotypes of mouse BMMSCs observed by FCM.图3 流式细胞术对BMMSCs 表型进行鉴定

Figure 4. Apoptosis of CD4 +T lymphocytes co-cultured with BMMSCs. Mean ±SD. n =8. * P ＜0.05 vs OVX group;##P ＜0.01 vs sham group.图4 BMMSCs 与T 淋巴细胞共培养中CD4 +T 淋巴细胞的凋亡情况

5 Real-time PCR 结果

去势组BMMSCs 中FasL 的表达水平较假手术组低，差异有统计学意义(P ＜0.05);给予BMMSCs 0 ～100 nmol/L 雌激素刺激24 h 后，随着雌激素浓度的增加，BMMSCs 中FasL mRNA 近似呈梯度上升，除100 nmol/L 组与10 nmol/L 组外，各浓度之间FasL表达的差异均有统计学意义(P ＜0.05)，见图5。

Figure 5. The mRNA expression of FasL in BMMSCs treated with different concentrations of estrogen (E2).A:the mRNA expression of FasL between sham group and OVX group. Mean ±SD.n =8. * P ＜0.05 vs OVX group. B:the mRNA expression of FasL in BMMSCs under stimulation of estrogen at different concentrations. Mean ±SD.n =5. △P ＜0.05 vs E2 0 nmol/L;#P ＜0.05 vs E2 0.1 nmol/L;▲P ＜0.05 vs E2 1 nmol/L.图5 不同雌激素条件下BMMSCs 中FasL mRNA 水平比较

6 Western blotting 结果

去势组中FasL 表达强度较假手术组明显降低(P ＜0.01)，给予BMMSCs 0 ～100 nmol/L 雌激素刺激24 h 后，随着雌激素浓度的增加，BMMSCs 中FasL蛋白水平近似呈梯度上升，除100 nmol/L 组与10 nmol/L 组外，各浓度之间FasL 表达有显著差异(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

Figure 6. Changes of the protein expression of FasL in BMMSCs treated with different concentrations of estrogen (E2). A:the protein level of FasL between OVX and sham group;B:the protein level of FasL expressed by BMMSCs under stimulation of estrogen at different concentrations. Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs OVX group;△P ＜0.05 vs E2 0 nmol/L;##P ＜0.01 vs E2 0.1 nmol/L;▲▲P ＜0.01 vs E2 1 nmol/L.图6 不同雌激素条件下FasL 蛋白水平的比较

讨 论

实验结果表明雌激素浓度影响BMMSCs 对T 淋巴细胞的凋亡程度，并且此现象与雌激素对BMMSCs表达FasL 的水平高低相一致，从而我们可以推测雌激素下降可能改变BMMSCs 中FasL 的水平抑制活化的T 淋巴细胞凋亡，进而促进骨质疏松的发生。实验中当雌激素浓度提高到100 nmol/L 时，BMMSCs中FasL 水平改变不明显，雌激素调控BMMSC 中FasL 水平的机制可能是FasL 的基因启动序列上存在雌激素应答元件(ERE)［11］，ERE 能和被雌激素激活的雌激素受体(ER)结合刺激FasL 基因表达。当雌激素浓度过高时，会减弱ER 与ERE 的结合，进而影响雌激素对FasL 的调控［12］。我们还在实验过程中发现OVX 组BMMSCs 在体外正常培养时(含雌激素培养液)，其FasL 水平在体外培养期间(约20 d 左右)并没有恢复，而sham 组的BMMSCs 在体外培养(无雌激素培养液)，其FasL 水平对外界低浓度的雌激素刺激发生了明显的变化，原因可能是长期的雌激素缺乏会对细胞产生一种“记忆效应”［13］，造成细胞难以短期恢复原有的生物学功能，这也可能是骨质疏松治疗中单纯给予雌激素短期内无法完全逆转症状的重要因素［14］。本文重点讨论了雌激素缺乏下BMMSCs 对活化CD4+T 淋巴细胞凋亡的影响，然而B 淋巴细胞以及破骨细胞前体在骨质疏松过程中同样发挥着作用。B 淋巴细胞在雌激素缺乏下数量增加，其生长因子IL-7 可导致T 细胞与巨噬细胞产生促炎症因子，引起骨量丢失［15］。破骨细胞前体在雌激素缺乏下凋亡降低，相关破骨基因表达增强，因此今后研究雌激素调节BMMSCs 表达FasL 对这些细胞是否具有凋亡作用将是一个很有意义的课题。在研究中我们仅从体外观察到了雌激素调控BMMSCs表达FasL 影响T 淋巴细胞的凋亡，未能阐明在体内BMMSCs 对T 淋巴细胞的凋亡作用。BMMSCs 是成骨细胞的前体，存在于骨髓腔中［16］，有机会与体内的淋巴细胞接触。但在体内BMMSCs 数量较少并且与T 淋巴细胞相互作用的机制仍然不明确，究竟自身的BMMSCs 在体内雌激素环境改变对活化T 淋巴细胞的凋亡作用发生变化能否引起骨质疏松仍值得我们后续研究。

本实验选择了雌激素缺乏导致的骨质疏松模型中骨髓间充质干细胞对CD4+T 淋巴细胞凋亡的影响进行研究，旨在探究在雌激素改变下骨髓间充干细胞在体外对活化T 淋巴细胞凋亡改变的分子机制，为骨质疏松的发生发展提供了理论基础。

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