盐酸环丙沙星乳膏无菌检查方法的建立*

于 翾，曹晓云

(天津市药品检验所，天津 300070)

盐酸环丙沙星乳膏用于治疗脓疮、疖肿、毛囊炎、湿疹并发感染等化脓性皮肤感染，按《中国药典》要求应进行无菌检查。本品无菌检查方法的难点在于如何消除盐酸环丙沙星的抑菌作用，由于盐酸环丙沙星乳膏为凡士林基质乳膏，含有液体石蜡、十八醇、白凡士林、甘油、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇400、聚山梨酯80和二甲基亚砜等多种辅料，为采用薄膜过滤法消除盐酸环丙沙星的抑菌作用，本文探讨了多种溶解稀释体系制备供试溶液，试验建立了盐酸环丙沙星乳膏的无菌检验方法，并按《中国药典》2010 年版要求进行了方法学验证试验，验证试验结果符合规定。用选定方法对三个厂家的样品进行无菌检查，方法可行，所建立的方法适用于盐酸环丙沙星乳膏的无菌检查。

1 试验材料

1.1 培养基硫乙醇酸盐流体培养基(批号120521)、改良马丁培养基(批号120522)、营养肉汤培养基(批号120626)、营养琼脂培养基(批号120529)、改良马丁琼脂培养基(批号120113)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号120510)，均为北京三药科技开发公司生产。

1.2 菌种 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］、大肠埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］、生孢梭菌(Clostridiun sporogenes)［CMCC(B)64941］、白色念珠菌(Clostridium sporogenes)［CMCC(F)98001］和黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98003］，均购自中国药品生物制品检定所。

1.3 样品 盐酸环丙沙星乳膏由广东顺峰药业有限公司(批号20090201)、海南碧凯药业有限公司(批号20100201)和广州白云山制药股份有限公司(批号P1023)提供。

2 方法与结果

2.1 试验菌液的制备 按照《中国药典》2010 年版二部附录XI H 无菌检查法项下方法制备。

2.1.1 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、生孢梭菌 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，35 ℃培养18 h。取经35 ℃培养18 h 的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌肉汤培养物1 ml，加9 ml 的0.9%无菌氯化钠溶液，以10 倍稀释至约10-5～10-7，混匀备用。取经35 ℃培养18 h 的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培养物1 ml，加9 ml 0.9%无菌氯化钠溶液，以10 倍稀释至约10-5～10-7，混匀备用。

2.1.2 白色念珠菌 取白色念珠菌新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，25 ℃培养24 h。取该培养物1 ml，加9 ml 0.9%无菌氯化钠溶液，以10 倍稀释至约10-5～10-7，混匀备用。

2.1.3 黑曲霉 将黑曲霉新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，25 ℃培养7 d，使大量孢子成熟。取该培养物加0.9%无菌氯化钠溶液4 ml 洗下孢子，吸出转移至空无菌试管作为原菌液，以10 倍稀释至约10-4～10-5，混匀备用。

各试验菌菌液浓度每1 ml 含10 ～100 cfu，平板计数结果见表1。各验证菌结果均符合《中国药典》要求。

表1 试验菌计数结果

2.2 真菌检查方法及验证试验 由于盐酸环丙沙星乳膏中含有多种基质，常规方法不容易得到溶液型供试液，采用薄膜过滤法有一定困难，故考虑使用直接接种法进行盐酸环丙沙星乳膏的真菌检查。采用直接接种法，取改良马丁培养基2 瓶，每瓶培养基装量为500 ml，分别接入白色念珠菌和黑曲霉的适宜稀释级菌液(＜100 cfu)，以上2 瓶分别加入每1 ml 中含0.2 g 的供试液25 ml，由于接入供试品的培养基呈浑浊状态，按规定温度培养5 d 后，取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，继续培养2 ～3 d。结果见表2。

表2 试验菌生长情况

2.3 细菌检查的方法及验证试验

2.3.1 预实验——直接接种法 盐酸环丙沙星乳膏属于喹诺酮类抗生素，为消除其抑菌作用，尝试在满足《中国药典》要求最低取样量条件下，通过降低取样量、加入适宜中和剂和增加培养基用量的方法，消除抑菌作用。参照文献选用0.1 mol/L 硫酸锰溶液作为中和剂［1］。取0.5 g 盐酸环丙沙星乳膏，与5 g 的聚山梨酯80 充分研磨混合均匀，加入0.1 mol/L 硫酸锰溶液稀释至10 ml，振摇使均匀分散，作为供试液。取供试液10 ml 直接接种至500 ml 培养基中，加入规定量的阳性对照菌，培养相应天数后转种，转种后各验证菌并未在规定时间内生长，该方法不能消除盐酸环丙沙星的抑菌作用，不能满足无菌检查要求。

2.3.2 预实验——薄膜过滤法 盐酸环丙沙星乳膏中含有多种基质，为采用薄膜过滤法消除盐酸环丙沙星的抑菌作用，尝试了多种供试液制备方法。以《中国药典》2010 年版常用稀释液0.1%蛋白胨水溶液、pH 7.0 氯化钠- 蛋白胨缓冲液、含1% 聚山梨酯80 的0.1%蛋白胨水溶液和含1%聚山梨酯80 的pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液制备供试液时，溶液均呈混悬状态，无法采用薄膜过滤法进行无菌检查。采用十四烷酸异丙酯为稀释剂制备供试液，可得到透明溶液，但经薄膜过滤法处理时，供试液堵塞滤膜，不能过滤;曾以聚山梨酯80 与供试品充分研磨，再加十四烷酸异丙酯进行稀释，所得供试液仍不能进行薄膜过滤。综合上述不同体系制备的供试液，采用离心或静置沉淀的方法，取上清液进行薄膜过滤。其中，取10 g 盐酸环丙沙星乳膏，与聚山梨酯80 混合均匀，再加无菌十四烷酸异丙酯溶解稀释，静置30 min，取上清液作为供试液，进行薄膜过滤法，经过不同冲洗液冲洗，各验证菌在规定时间内生长，该方法符合《中国药典》规定。

2.3.3 薄膜过滤法及方法验证试验

2.3.3.1 无菌检查方法 取本品，加4 倍量聚山梨酯80 研磨均匀，加无菌十四烷酸异丙酯混合均，使成每1 ml 中含25 mg 的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液40 ml，静置30 min 后取上清液20 ml，采用薄膜过滤法处理，结果较为理想。由于盐酸环丙沙星乳膏基质溶解于十四烷酸异丙酯中，供试液过滤后如果以水溶液冲洗滤膜，基质会析出成为絮状沉淀，堵塞滤膜，故先用无菌十四烷酸异丙酯分4 次冲洗(每膜不少于200 ml)，再用含1%聚山梨酯80 的0.1%无菌蛋白胨水溶液分次冲洗(每膜不少于800 ml)，注入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml。依上述方法以聚山梨酯80和十四烷酸异丙酯制备的供试液，在每张滤膜上的过滤量有限，为减少滤膜的堵塞，静置后取半量上清液过滤，应考虑采用多膜过滤保证满足《中国药典》最少检验量要求。本品以大肠埃希菌为阳性对照菌［2，3］，依法检查(《中国药典》2010 年版二部附录ⅪH)。

2.3.3.2 方法验证试验 ①供试品组:取本品1 g，与4 g 聚山梨酯80 研磨均匀，加无菌十四烷酸异丙酯至40 ml，混合均匀，制成每1 ml 中含25 mg 的溶液。静置30 min 后取上清液20 ml，采用薄膜过滤法处理，先用无菌十四烷酸异丙酯分4 次冲洗(每膜不少于200 ml)，再用含1%聚山梨酯80 的0.1%无菌蛋白胨水溶液分次冲洗(每膜不少于800 ml)，在最后一次冲洗液中加入少于100 cfu 的需验证试验菌，滤干后，注入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml。②阳性对照:另取一装有同体积的培养基容器，加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培养3 ～5 d。各试验菌同法操作。③阴性对照:硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基无菌性检查应符合规定。④各验证菌结果均符合《中国药典》要求。见表2。

2.4 样品检验 取本品，与4 倍量聚山梨酯80 研磨均匀，加无菌十四烷酸异丙酯混合均匀使成每1 ml 中含25 mg 溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液40 ml，静置30 min 后取上清液20 ml，采用薄膜过滤法处理，先用无菌十四烷酸异丙酯分4 次冲洗(每膜不少于200 ml)，再用含1%聚山梨酯80 的0.1%无菌蛋白胨水溶液分次冲洗(每膜不少于800 ml)，注入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml，同法制备10 份。另取本品适量，置含玻璃珠灭菌容器内加0.1%无菌蛋白胨水溶液混合均匀使成每1 ml 中含0.2 g 的溶液，取25 ml 置500 ml 改良马丁培养基中。以大肠埃希菌为阳性对照菌［3，4］，依法检查(《中国药典》2010 年版二部附录ⅪH)，应符合规定。

3 讨论

3.1 真菌检查也可以与细菌检查相同，采用薄膜过滤法进行，考虑到试验的便捷性，最后采用直接接种法进行实验。

3.2 薄膜过滤法进行细菌检查时，先用无菌十四烷酸异丙酯分次冲洗，再用含1%聚山梨酯80 的0.1%无菌蛋白胨水溶液分次冲洗，可以有效消除盐酸环丙沙星的抑菌性，同时防止基质析出，堵塞滤膜。

3.3 试验结果显示，供试组与阳性对照组中试验菌细菌均在1 d 内生长良好，试验菌真菌均在2 d 内生长良好，符合验证要求，表明在上述试验条件下，可消除样品的抑菌活性，对微生物的生长无影响。

采用本方法进行盐酸环丙沙星乳膏无菌检查，消除了抑菌作用，符合《中国药典》相关规定，在一定程度上保证了无菌检查方法的科学有效，为盐酸环丙沙星乳膏的质量标准制定提供了有效保证。

1 马仕洪，刘鹏，戴翚，等. 加替沙星无菌检查方法的建立与标准操作探讨［J］. 药物分析杂志，2007，27(6):877

2 麻明臣，邱海滨，李志新，等. 建立乳酸环丙沙星氯化钠注射液的无菌检查方法［J］. 中国药事，2008，22(3):251

3 刘广桢，林林，徐晓洁，等. 乳酸环丙沙星氯化钠注射液无菌检查法的验证［J］. 中国药品标准，2008，9(1):38