高效液相色谱仪自动进样器校准方法及不确定度评定*

王冠杰，季士委，田利，曹守春，邹健

（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

杨洋

（北京市计量检测科学研究院，北京 100029）

高效液相色谱仪是复杂样品定性和定量分析的常用设备，广泛应用于医疗卫生、食品科学、环境科学和航天科学等多个领域［1］。在药品检测领域，使用高效液相色谱法的标准品种从1985 年版药典的7 种，增加至2005 年版药典的1 327 种［2］，2010年版《中国药典》［3］更是增加至约2 000 种，其在药品检验领域中的作用日益显著。随着液相色谱技术的发展，高端液相色谱仪多数配备了自动进样器，而目前我国液相色谱仪检定规程没有提供自动进样器校准方法［4］。在检测样品尤其是微量样品的过程中，自动进样器是否准确直接影响检测结果的重复性和准确性［5-6］。

中国食品药品检定研究院作为国家级药品检测机构，在申请WHO 预认证中，按照欧洲医药管理局（OMCL）《质量控制文件》［7］提供的计量方法为基础，对液相色谱自动进样器进行校准。

现结合实验经验和OMCL 提供的方法，归纳自动进样器检测方法并对进样体积误差不确定度进行评定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Waters e2695 型，新加坡Waters Pacific Pte Ltd 公司；

电子天平：ME414S 型，量程为0～410 g，分度值为0.1 mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

甲醇：色谱纯；

萘-甲醇溶液：100 μg／mL，国家二级标准物质［GBW(E) 130167］，中国计量科学研究院；

实验用水：一级水（电阻率≥18 MΩ·cm）。

1.2 色谱条件

1.2.1 进样体积误差实验

流动相：甲醇；流速：1.0 mL／min；进样体积：50 μL；运行时间：0.1 min；连续进样次数：6 次。

1.2.2 进样残留实验

标准物质：100 μg／mL 萘-甲醇溶液；流动相：100%甲醇，流速为1.0 mL／min；色谱柱：C18色谱柱；检测器：紫外可见光（或二极管阵列）检测器；检测波长：254 nm；进样体积：20 μL。

1.2.3 进样重复性实验

同1.2.2。

1.3 实验方法

1.3.1 进样体积误差

在2 mL 的标准进样小瓶中加入约1.5 mL 经脱气的一级水，用聚四氟乙烯（或者预切缝）的隔垫密封小瓶，使用小钳子或者戴手套称量小瓶，记录质量W1(g)。按照1.2.1 建立检测序列。序列完成后，使用小钳子或者戴手套称量小瓶，记录质量W2(g)。自动进样器的进样体积误差按公式（1）计算：

1.3.2 进样重复性

建立检测序列：共进样7 次，其中A（流动相空白）进样1 次，B（萘-甲醇溶液）进样6 次。自动进样器的进样重复性计算方法：对萘-甲醇溶液的6 次分析谱图进行积分，分别得到相应的峰面积和峰高，计算6 个色谱峰的峰面积和6 个峰高的相对标准偏差，峰面积相对标准偏差应不大于1.0%，峰高的相对标准偏差应不大于2.0%［7］。

1.3.3 进样残留

建立检测序列：共进样2 次，其中A（萘-甲醇溶液）进样1 次，B（流动相空白）进样1 次。对萘-甲醇溶液和流动相空白的2 次分析谱图进行积分，分别得到相应的色谱峰峰面积和峰高，计算空白溶液的响应值（面积或峰高）与萘-甲醇溶液响应值（面积或峰高）的比值。空白与萘-甲醇溶液峰面积比值应不大于0.2%，峰高比值应不大于0.4%［7］。

1.4 注意事项

在进样针头为塑料时使用预切缝的隔垫是为了避免在连续进样中产生真空，进样针使用钢针头时则不必使用预切缝的隔垫。使用水作称量介质，是因为水的密度在室温20～25℃范围内体积变化很小。称量时应使用万分之一或者十万分之一的电子天平。如果进样体积小于50 μL，进样次数至少要大于10 次。

实验方法中的参考值均是依据仪器制造商对仪器进行标准验证时的技术要求给出的。在仪器工作状况良好时，经过对上述3 项进行检测，相关指标确实可以达到。

2 进样体积误差不确定度来源及评定

2.1 数学模型

自动进样器进样体积误差可以表示为：

根据公式（2），自动进样器进样体积误差ΔX的标准不确定度为：u(ΔX设定)=u(X实测)。

2.2 测量重复性引入的相对标准不确定度u1

选择进样重复性中的最大参考值2.0%［7］，进样6 次（n=6），则：

2.3 称量引入的相对标准不确定度 2

根据天平的检定证书得知天平为I 级，最大允许误差±0.5 mg（量程为0～50 g），则：

2.4 温度波动导致水体积变化引入的相对标准不确定度u3

在室温20～25℃范围内，水的密度随温度变化而引起的体积变化为0.3%［7］，即u3=0.3%。

2.5 合成相对标准不确定度

由于各分量的不确定度互不相关，所以自动进样器进样体积误差ΔX 相对合成不确定度为：

2.6 相对扩展不确定度

取包含因子k=2，被检测自动进样器的进样体积误差的扩展不确定度为：

2.7 说明

由于进样重复性的测量结果是进样体积误差的一个不确定度分量，而进样残留的测量结果实质上只是空白和标准样品峰面积（或峰高）的一个比值，所以没有对这两项做不确定度分析，只对进样体积误差进行了不确定度的分析。

3 评定案例

根据上述方法对中国食品药品检定研究院29台液相色谱仪的自动进样器进行校准，结果显示28台设备自动进样器合格，1 台设备自动进样器进样体积重复性（RSDA）为1.5%（＞1.0%），具体情况见表1。

4 结语

通过建立液相色谱仪自动进样器的校准方法及不确定度评定，可以有效检验液相色谱仪的工作状态，提高检测数据的准确性，值得推广使用。

表1 液相色谱自动进样器进样重复性测定结果

［1］ 孙会敏.高效液相色谱法简介及其在药品检验中的应用［J］.齐鲁药事，2011，30(11): 38-42.

［2］ 叶显撑,范国荣,祝德秋.液-质联用在体内药物分析中的应用［J］.中国医院药学杂志，2011，31(4): 317-319.

［3］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［4］ JJG 705-2002 液相色谱仪［S］.

［5］ 王冠杰，杨洋，肖镜.WHO 药品预认证对液相色谱仪性能验证的要求及比较分析［J］.中国药事，2013，27(5): 504-507.

［6］ 王家威.世界卫生组织药品预认证项目的概述及发展方向［J］.中国药事，2009，23(4): 390-392.

［7］ OMCL Network of the Council of Europe. Quality Management Document PA/PH/OMCL (11) 04- Annex 1［S］.