溶血及宫颈黏液对人乳头状瘤病毒DNA检测结果的影响

谢秋华 有 军

浦东新区公利医院检验科，上海 200135

人类乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是导致宫颈癌及癌前病变的主要因素[5，7]。目前Real-time PCR 技术广泛被实验室用于检测HPV 感染[4，6，8]，用于检测HPV 的宫颈脱落细胞样本，即使严格按照采样规范进行样本采集，但收集到的样本仍不可避免地混有血液或宫颈黏液。本研究通过对含不同浓度血红蛋白（hemoglobin，Hb）或宫颈黏液的宫颈脱落细胞样本，采用Real-time PCR 法进行检测，探讨溶血及宫颈黏液对HPV DNA检测结果的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年9月—2013年5月内本院妇科门诊就诊的女性患者宫颈脱落细胞标本作为研究对象。选取其中HPV 检测为阳性的标本进行研究，患者年龄19～53岁，平均年龄（34.3±8.2）岁，其中随机抽取10例未溶血且不含宫颈黏液的阳性样本作为溶血组初始样进行试验，10例未溶血而富含宫颈黏液的阳性样本作为黏液组初始样本进行试验。

1.2 仪器与试剂

PCR 反应扩增仪为ROCHE Lightcycler1.2;核酸的抽提、扩增及检测试剂购自港龙生物技术（深圳）有限公司。

1.3 样本采集和分组

所有样本均经被采集本人知情同意，严格按照宫颈脱落细胞样本采集规范采集，采集后样本尽快送检，4℃保存不超过1 d，-20℃保存不超过6 个月。溶血试验组样本为未溶血且不含宫颈黏液的阳性样本，黏液组试验样本为未溶血而富含宫颈黏液的阳性样本。

1.4 溶血样本的制备

取本实验室收到的多个宫颈脱落细胞重度溶血样本，检测其Hb 浓度以确定所制备溶血样本的Hb 浓度范围，检测得到Hb 浓度＜5 g/L，故溶血样本Hb 浓度取5 g/L 和10 g/L。

取一份女性健康体检的志愿者EDTA-K2 抗凝的“O”型全血样本4 mL，加入15 mL 离心管，2000 g 离心5 min 后吸弃血浆，加入10 mL 无菌生理盐水并震荡混匀，2000 g 离心5 min 后去上清，重复洗涤2 次。加入2 mL 无菌生理盐水悬浮红细胞，测定悬液Hb 浓度，然后用无菌生理盐水稀释成相应度浓度的红细胞悬液，-30 ℃与常温10 min 冻融1 次，制成含部分未裂解红细胞的Hb 悬液。

取初始样本500 μL/份1:1 加入Hb 悬液并混匀，得到Hb 终浓度不同而HPV 含量相同的模拟溶血样本。未溶血组为500μL 初始样本加500 μL 无菌生理盐水（Hb 为0 g/L），溶血组为500 μL初始样本加入500 μL Hb 悬液，Hb 终浓度分别为5 g/L 和10 g/L。

1.5 宫颈黏液样本的处理

样本分为黏液未处理组、冻融解黏组和NaOH 解黏组进行检测。黏液未处理组组取500 μL 初始样本；冻融解黏组取初始样本500 μL 经冻融解黏处理；NaOH 解黏组取500 μL 初始样本加入500 μL NaOH（0.1 mol/L）进行处理。

1.6 HPV DNA 检测步骤

主要检测步骤包括HPV DNA 提取，PCR 扩增检测，每一步均严格按照试剂说明书进行操作。

1.7 结果判断

以PCR 扩增检测得到的HPV DNACt 值进行判断：无数值报高危型HPV 阴性；Ct 值小于37 报高危型HPV 阳性；Ct 值在37～40 之间，复检；重新检测结果Ct 值＜40 报高危型HPV 阳性，无Ct 值报高危型HPV 阴性。

1.8 统计学处理

统计学处理采用SAS 8.0 软件包进行统计学分析：定量资料采用（）表示，行随机区组的方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 溶血对HPV DNA 扩增Ct 值结果的影响

为了观察溶血对HPV DNA 扩增Ct 值结果的影响，在初始样本中分别加入生理盐水和Hb 悬液，制成Hb 终浓度为0、5、10 g/L的溶血样本。结果发现，随着Hb 浓度由0 g/L 增加至10 g/L，三组对HPV DNA 扩增检测Ct 值结果的差异无统计学意义（F=0.96，P=0.4019），见表1。

表1 溶血对HPV DNA 扩增Ct 值的影响

2.2 宫颈黏液对HPV DNA 扩增Ct 值结果的影响

为了观察宫颈黏液对HPV DNA 扩增Ct 值结果的影响，按是否进行解黏处理分为黏液未处理组、冻融解黏组和NaOH 解黏组进行检测。结果发现，三组间Ct 值结果差异有统计学意义（F=46.28，P＜0.0001）；其中冻融解黏组和NaOH 解黏组Ct 值结果与黏液未处理组相比，Ct 值结果减小，差异有统计学意义（P＜0.05），而冻融解黏组与NaOH 解黏组相比，Ct 值的差异无统计学意义（P ＞0.05），见表2。

表2 宫颈黏液对HPV DNA 扩增Ct 值的影响

3 讨论

目前HPV DNA 检测被广泛应用于临床检测，而检测结果的准确性往往与病毒核酸的提取及样本的性质密切相关。在样本采集过程中尽管已严格按照操作规程如避开妇女的月经期等，但在某些情况下采集到的样本依然不可避免地出现混有血液或者宫颈黏液等现象。本研究通过Real-time PCR 技术对宫颈脱落细胞样本进行HPV DNA 检测，结果发现，溶血对结果不产生影响，宫颈黏液经冻融或NaOH 解黏化处理后能减少黏液对检测的干扰，降低复检率。

Hb 中的血红素可抑制DNA 聚合酶的活性，降低荧光定量PCR 检测结果，甚至出现假阴性[3]。伍金华等[2]研究发现，在用导流杂交基因芯片技术检测人乳头状瘤病毒分型过程中，Hb 对该检测结果没有影响。在本研究中，当Hb 终浓度分别为0、5、10 g/L时，HPV DNA 的Ct 值的变化不大，结果表明检测Hb 亦不结果影响Real-time PCR 技术对宫颈脱落细胞样本的HPV DNA 检测。

宫颈黏液的多少与妇女生理性周期性的变化或病理变化相关，采样过程中并不能完全杜绝样本带有黏液情况的出现。陈凤等[1]研究显示，第2 代杂交捕获法检测HPV DNA，其检测结果不受样本带有分泌物的影响，而伍金华等[2]研究发现，在导流杂交基因芯片技术检测人乳头状瘤病毒时，有黏液组标本复检率高于无黏液组。因DNA 相对耐碱且宫颈黏液样本-30℃冻存一定时间后复融会发生解黏现象，本研究中对宫颈黏液进行冻融或NaOH 处理以达到解黏目的。检测结果发现，与黏液未处理组相比，冻融解黏组、NaOH 解黏组Ct 值结果减小（P＜0.05），表明解黏有助于HPV DNA 的检测。本研究所中对含宫颈黏液样本的经冻融或加NaOH 进行解黏处理后，需复检的样本数由3/10 降为0/10，降低了样本的复检率。探讨其原因有①样本吸样及离心后去上清过程中受到宫颈黏液特影响，可能造成上皮细胞的丢失或稀释，进而影响检测结果。②抽提过程中，样本中含有的黏液使上皮细胞未能充分裂解并释放病毒，从而影响抽提效果。③黏液样本中可能含有较多的内源性抑制物如黏蛋白、免疫球蛋白和蛋白酶等，可能干扰核酸提取或者抑制聚合酶活性。

综上所述，Real-time PCR 法检测HPV DNA 时，溶血与否不影响该方法对宫颈脱落细胞样本HPV DNA 的检测结果；对宫颈黏液进行冻融或NaOH 解黏处理后可有效清除黏液对检测的干扰，降低复检率。对于宫颈黏液合并溶血的样本是否对检测结果有影响，尚待进一步研究。

[1]陈凤，沈艳红，刘彬，等.第二代杂交捕获法检测子宫颈瘤人乳头瘤病毒影响因素的研究[J].中华医学杂志，2005，85(2)：129-130.

[2]伍金华，吴艳梅，牛映红.血红蛋白和宫颈黏液对人乳头状瘤病毒分型的影响[J].检验医学与临床，2012；9(10)：1180-1182.

[3]Akane A，Matsubara K，Nakamura H，et al.Identification of heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from Bloodstains，a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification [J].J Forensic Sic，1994，39（2）：362-372.

[4]Castle PE，Stoler MH，Wright TC Jr et al.Performance of carcinogenic human papillomavirus (HPV) testing and HPV16 or HPV18 genotyping for cervical cancer screening of women aged 25 years and older:a subanalysis of the ATHENA study[J].Lancet Oncol，2011，12(9)：880-890.

[5]Dalstein V，Briolat J，Birembaut P，et al.The epidemiology of genital human papillomavirus infections[J].Rev Prat，2006，56 (17)：1877-1881.

[6]Depuydt CE，Benoy IH，Beert JF，et al.Clinical Validation of a Type-Specific Real-Time Quantitative Human Papillomavirus PCR against the Performance of Hybrid Capture 2 for the Purpose of Cervical Cancer Screening[J].J Clin Microbiol，2012，50 (12)：4073-4077.

[7]Du J，Nsman A，Carlson JW，et al.Prevalence of human papillomavirus(HPV) types in cervical cancer 2003-2008 in Stockholm，Sweden，before public HPV vaccination[J].Acta Oncol，2011，50(8)：1215-1219.

[8]Jentschke M，Soergel P，Lange V，et al.Evaluation of a new mμLtiplex real-time polymerase chain reaction assay for the detection of human papillomavirus infections in a referral popμLation [J].Int J Gynecol Cancer，2012，22(6)：1050-1056.