锁阳多糖对H2O2 诱导非洲绿猴肾上皮细胞氧化损伤的保护作用

刘 琴， 宋 珅， 郭 杰， 罗 顺， 张 继，2*

(1. 西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州730070;2. 甘肃特色植物有效成分制品工程技术研究中心，甘肃 兰州730070;3. 甘肃万州建顺生物科技有限公司，甘肃 兰州730070)

锁阳又名不老药，是锁阳科植物Cynomorium songaricum Ruhr 的干燥肉质茎。其性甘温，具有补肾阳、益精血、润肠通便之功能。临床用于腰膝痿软，阳痿滑精，肠燥便秘等。目前对锁阳的报道以多糖类物质居多，如多糖的提取工艺研究［1］，多糖对染色体端粒长度的影响［2］，然而关于其抗氧化活性检测方面鲜有报道。锁阳主要有有机酸、黄酮类、三萜类、甾体类、挥发性成分、氨基酸类、糖类、缩合型鞣质等多种化学成分［3-4］，其中多糖类物质的体外清除自由基的作用已有研究［5］，但是关于细胞水平的研究鲜有报道。H2O2是一种常用的细胞氧化应激诱导剂，广泛用于诱导细胞建立氧化应激模型［6］。VERO 细胞株即非洲绿猴肾上皮细胞，生长迅速，性状稳定，对药物敏感，且最重要的一点是猿猴较接近人类，用该细胞进行肾脏疾病方面的研究可以减少免疫学方面的问题［7］。故本研究采用VERO 细胞建立氧化损伤模型，旨在研究锁阳多糖是否对VERO 细胞氧化损伤具有保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料 锁阳，产地为甘肃酒泉，60 ℃，24 h烘干，粉碎，过100 目筛，备用。

非洲绿猴肾上皮(VERO)细胞购自ATCC。DMEM -F12 培养基和新生牛血清(Gibco 公司);青霉素(华北制药股份有限公司);链霉素(大连美罗大药厂);MTT (Sigma-Aldrich 公司);超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛和乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)，ROS 活性检测试剂盒和Caspase-3 活性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所);其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器 CO2培养箱(Thermo Scientific 公司);Vi-cell 细胞计数分析仪(Beckman 公司);生物安全柜(力康生物医疗科技控股有限公司);倒置显微镜 (OLYMPUS 公司);SpectraMax M5 酶标仪(美国分子仪器有限公司);UV2450 紫外分光光度计(上海美析仪器有限公司);荧光分光光度计(上海精密仪器有限公司);高速低温离心机(Beckman 公司);电子天平(天津市天马仪器厂);超声细胞破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 锁阳多糖的制备 取一定量的粉碎好的锁阳粉末，按照张思巨等［8］的方法分离和纯化锁阳多糖，苯酚硫酸法［9］测得含糖量为89.2%，凝胶阻滞色谱法［10］测得其相对分子质量为48.1 ×104(Mw)，GC-MS 法分析［11］表明，锁阳多糖由Man、Glu 和Gal 3 种单糖组成，摩尔比为5.01 ∶89.17 ∶5.82。

1.3.2 VERO 细胞复苏与培养 将冻存的VERO细胞从液氮罐中取出，迅速在37 ℃水浴中融化。根据冻存密度，接种1 ×106个于含10%小牛血清的DMEM-F12 培养基的75 cm2T-FLASK 培养瓶中，置37 ℃，5%CO2培养箱中培养，次日换液。

当细胞长满瓶底后，弃去原培养液，用PBS缓冲液洗涤两次;然后用0.25%的胰酶消化，3 ～5 min 后于倒置显微镜下观察消化程度;大部分细胞变圆，细胞间连接疏松，表明消化适度，加入少量含10%小牛血清的DMEM-F12 培养液终止消化;吹打，制成单细胞悬液。取少量悬液通过Vi-cell测试细胞密度，接种所需的密度于培养瓶或者培养板中进行后续试验。

1.3.3 H2O2诱导VERO 细胞氧化损伤模型的建立

参照张生等［12］的实验方法，将生长于对数期的VERO 细胞按照1 ×104个/孔接种于96 孔培养板中，待细胞贴壁后加入浓度梯度为100、200、400、800、1 000 μmol/L 的H2O2，每组4 个复孔，置37 ℃，5%CO2培养箱中分别孵育0.5、1、1.5、2 h，MTT 法检测细胞存活率，选择细胞存活率接近50%时的H2O2的浓度作为最佳作用浓度。

1.3.4 锁阳多糖对正常VERO 细胞的影响 将生长于对数期的VERO 细胞按照密度为1 ×104个/孔接种于96 孔板中，待细胞贴壁后用于实验。实验分6 组，空白对照组、锁阳多糖0.062 5、0.125、0.25、0.5 和1 mg/mL 剂量组，在37 ℃、5%CO2条件下分别培养24 h 后，弃去培养基，加入MTT液(PBS 液配制，终质量浓度为0.5 mg/mL)。继续培养4 h后，吸去上清液，加入异丙醇，吹打至蓝色结晶物完全溶解，酶标仪测570 nm 处吸光度(A)。细胞存活率(%) =［A570(样品组)/A570(空白对照组2)］ × 100%。

1.3.5 锁阳多糖对H2O2诱导VERO 细胞氧化损伤的保护作用 细胞处理同“1.3.4”项。待细胞贴壁后加入等体积250、500 和1 000 μg/mL 的锁阳多糖，每组6 复孔。分别孵育8、12、24 h 后，加入终浓度为800 μmol/L 的H2O2，继续孵育1 h后，MTT 法检测细胞存活率。

1.3.6 乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的测定 细胞处理同“1.3.5”项。细胞经多糖处理后，H2O2处理1 h，收集上清液，严格按照LDH 试剂盒说明测试LDH 释放量。440 nm 处测吸光值。LDH 释放量用总LDH 活性(培养基中的LDH + 细胞内的LDH)的百分比来表示，计算公式:LDH 释放量(%)=(培养基LDH 活性/总LDH 活性)×100%

1.3.7 荧光光度法检测caspase-3 活性 细胞处理同“1.3.5”项，处理完成后，1 000 ×g，4 ℃离心5 min 收集细胞，PBS 洗涤1 次。取2 ×106个细胞加入100 μL 裂解液，冰浴裂解15 min。4 ℃，16 000 ～20 000 ×g 离心10 ～15 min，将上清转移到预冷的离心管中。取出10 μL 加入反应体系37 ℃温育，变色以后，于405 nm 测吸光度，严格根据产品说明书操作。

1.3.8 DCFH-DA 荧光探针检测细胞内ROS 水平细胞处理同“1.3.5”项。细胞经多糖处理后，H2O2处理1 h，收集细胞，加入终浓度为10 μmol /L的DCFH-DA 的无血清培养液1 mL，于37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3 ～5 min 颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清培养基洗涤细胞3 次，充分除去未进入细胞内的DCFH-DA。荧光分光光度计测定 (激发波长为488 nm，发射波长为521 nm)细胞内荧光强度。

1.3.9 抗氧化指标的测定 细胞处理同“1.3.5”项。细胞经多糖处理后，H2O2处理1 h，收集细胞，超声破碎细胞，根据GSH-Px、SOD 和MDA 试剂盒说明，检测VERO 细胞内GSH-Px、SOD 活性和细胞培养液中MDA 水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 软件进行统计学处理，采用独立样本t 检验和单因素方差分析检验差异显著性。各组数据用(±s)表示。

2 结果与分析

2.1 H2O2对VERO 细胞存活率的影响 结果如图1 所示，不同浓度的H2O2分别处理VERO 细胞0.5、1、1.5、2 h 后，细胞存活率显著下降(*P ＜0.05，#P ＜0.01)，有剂量依赖性和时间依赖性。根据IC50规则，符合进一步实验要求的损伤时间和损伤浓度分别为:100 μmol/L 处理2 h，400 μmol/L 处理1.5 h，800 μmol/L 处理1 h，以此建立VERO 细胞的氧化损伤模型。在这3 个时间，细胞损伤程度均在50%左右，这样既能使细胞受到明显的损伤，又不至于造成细胞的过度凋亡，有利于进一步实验的探讨。

2.2 锁阳多糖对正常VERO 细胞的影响 由表1可以看出，与对照组相比，锁阳多糖预处理24 h对正常的VERO 细胞的活力没有明显的影响。

2.3 锁阳多糖对H2O2诱导VERO 细胞氧化损伤的保护作用 如图2 所示，与对照组相比，H2O2能明显降低VERO 细胞的存活率(##P ＜0.01)。与H2O2模型组相比，不同质量浓度 (0.25 ～1 mg/mL)的锁阳多糖预处理12、24 h，能够明显改善H2O2引起的VERO 细胞存活率的降低(＊＊P ＜0.01)，并且有剂量依赖性。预处理8 h，其保护作用不明显。

图1 不同浓度H2O2 对VERO 细胞增殖的影响(n=6)Fig.1 Effect of different concentrations of H2O2 on proliferation of VERO cells (n=6)

表1 锁阳多糖对正常VERO 细胞OD 值的影响(n=6)Tab.1 Effect of polysaccharide from Cynomorium songaricum Rupr on the OD of VERO cells (n=6)

图2 不同质量浓度的锁阳多糖对H2O2 损伤VERO 细胞存活率的影响(n=6)Fig.2 Effect of different concentrations of polysaccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on H2O2-induced viability of VERO cells (n=6)

2.4 锁阳多糖对H2O2损伤VERO 细胞的LDH 漏出量的影响 由图3 所示，与对照组相比，H2O2模型组的LDH 漏出量明显增加(##P ＜0.01)，说明H2O2对VERO 细胞造成损伤，使得细胞中的乳酸脱氢酶(LDH)释放到了细胞培养液中。与模型组相比，加入锁阳多糖处理后，能明显降低LDH 漏出量(＊＊P ＜0.01)，并且随着锁阳多糖质量浓度的升高。LDH 漏出量减少，表现出一定的剂量依赖性，表明锁阳多糖能够保护细胞免受H2O2的损伤。

图3 不同质量浓度的锁阳多糖对H2O2 损伤的VERO 细胞LDH 漏出量的影响(n=6)Fig.3 Effect of different concentrations of ploysccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on LDH leakage of VERO cells injured by H2O2 (n=6)

2.5 caspase-3 活性检测VERO 细胞凋亡 如图4所示，与对照组相比，细胞经800 μmol/L H2O2处理1 h 后，caspase-3 活性明显升高(#P ＜0.01)，表明H2O2诱导VERO 细胞发生了凋亡，而锁阳多糖自身对caspase-3 的活性没有影响。与模型组相比，在用H2O2诱导损伤之前，细胞经不同质量浓度(0.5、1 mg/mL)锁阳多糖预处理后，caspase-3 活性剂量依赖性的降低(＊＊P ＜0.01)，表明锁阳多糖能够保护细胞免于H2O2损伤，间接抑制细胞凋亡。

2.6 锁阳多糖对H2O2诱导VERO 细胞内ROS 水平影响 如图5 所示，与对照组相比，H2O2模型组的ROS 水平明显升高(##P ＜0.01)，表明H2O2能诱导VERO 细胞产生ROS，而与模型组相比，不同质量浓度的锁阳多糖能够明显降低ROS 水平(＊＊P ＜0.01)，并且随着锁阳多糖质量浓度的增加，ROS 水平降低越明显，表明锁阳多糖能够显著抑制H2O2诱导VERO 细胞产生活性氧。

图4 锁阳多糖对H2O2 诱导的VERO 细胞的caspase-3 活性的影响(n=6)Fig.4 Effect of ploysccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on H2O2-induced activation of caspase-3 of VERO cells (n=6)

图5 不同质量浓度的锁阳多糖对H2O2 损伤的VERO 细胞内ROS 水平的影响(n=6)Fig.5 Effect of different concentrations of ploysccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on H2O2-induced intracellular accumulation of ROS in VERO cells (n=6)

2.7 抗氧化指标的测定结果 表2 数据显示，与对照组相比，模型组的MDA 水平显著升高(#P ＜0.01);SOD 和GSH-Px 活力显著降低(#P ＜0.01)，说明H2O2对VERO 细胞造成了损伤，使得细胞培养液中MDA 水平升高，使得细胞内SOD 和GSH-Px活力降低，清除自由基能力下降。与H2O2模型组相比，多糖组的MDA 水平降低(＊＊P ＜0.01)，SOD 和GSH-Px 活力升高(＊＊P ＜0.01)，表明锁阳多糖具有抗氧化能力。

表2 锁阳多糖对SOD 和GSH-Px 活性以及MDA 水平影响(n=6)Tab.2 Effect of polysaccharide from Cynomorium songaricum Rupr on the activities of SOD，GSH-Px and MDA of VERO cell (n=6)

3 讨论

正常的VERO 细胞自身拥有一套清除自由基的酶系统，能将新陈代谢中生成的自由基清除，当细胞受到外界的氧化损伤时，细胞产生的自由基超过了其自身的自由基清除能力，过多的自由基使得细胞膜中的不饱和脂肪酸被氧化，导致细胞膜的液态性、流动性和通透性均发生变化，最终使膜功能发生障碍，引发肾结石等疾病［13］。由于肾脏疾病难以在原位进行研究，利用体外培养肾上皮细胞建立氧化损伤模型，避免了全身神经体液、激素水平及局部不同类型细胞间的相互影响，为更深入的从细胞水平研究肾脏疾患提供了良好的模型［14］。

本实验研究通过利用H2O2诱导的VERO 细胞损伤模型，研究锁阳多糖对VERO 细胞氧化损伤的保护作用。实验结果表明，H2O2对VERO 细胞具有氧化损伤作用，其损伤程度呈现时间依赖性(0 ～2 h)和剂量依赖性(0 ～1 mg/mL)。其中800 μmol/L 处理1 h 可使VERO 细胞产生显著的损伤，而分离纯化的锁阳多糖可显著提高经H2O2损伤后的VERO 细胞的存活率，使得损伤性VERO细胞LDH 的漏出量显著降低，这可能是因为锁阳多糖对VERO 细胞膜起到了保护作用，从而阻止了LDH 很快释放到细胞培养上清液中。

活性氧如过氧化氢和羟自由基容易破坏生物分子，这可能最终导致细胞凋亡或坏死［15］。通过抗氧化剂去除多余的活性氧或抑制其生成可以有效地防止细胞氧化。本实验结果表明锁阳多糖能够明显降低由H2O2引起的VERO 细胞内ROS 水平的变化，并且有剂量依赖性。此外，H2O2处理后的VERO 细胞内caspase-3 活性明显升高，经锁阳多糖预处理后，caspase-3 活性剂量依赖性的降低，这表明锁阳多糖能够间接抑制H2O2引起的VERO细胞的凋亡，其具体的作用机制有待进一步研究。

抗氧化指标测定结果显示，模型组的SOD 和GSH-Px 活性显著下降，MDA 水平显著升高。而不同质量浓度的锁阳多糖处理后各组的抗氧化酶活性均有所升高，MDA 水平均降低，并且随着多糖质量浓度增大，作用越显著，这表明锁阳多糖能够提高VERO 细胞的抗氧化能力。

综上所述，本研究通过使用H2O2建立VERO细胞氧化应激损伤模型，观察锁阳多糖对氧化应激损伤的保护作用，发现锁阳多糖可以増加细胞内抗氧化系统的活性，调节细胞内抗氧化酶活性，维持细胞内抗氧化系统的正常水平，明显减少细胞内活性氧簇的形成，并显示出抗凋亡作用。这些综合作用的结果，可能就是锁阳多糖能够起到保护VERO细胞作用的重要因素，这个结果为进一步研究锁阳多糖潜在的防治肾脏相关疾病展示了乐观的前景。

［1］ 刘晔玮，邸多隆，葛 斌，等. 锁阳多糖提取工艺的研究［J］. 天然产物研究与开发，2006，18(6):1007-1009.

［2］ 马丽杰，陈贵林，聂丽莎，等. 锁阳多糖对D-半乳糖衰老小鼠血细胞和脑细胞染色体端粒的长度的影响［J］. 中国中药杂志，2009，34(5):1257-1259.

［3］ 谢石安，李国玉，王航宇，等. 锁阳化学成分的研究［J］.中国药师，2012，52(7):112-115.

［4］ Tao J，Tu P F，Xu W H，et al. Studies on chemical constituents and pharmacological effects of the stem of Cyonmorium songaricum Rupr［J］. Chin Mate Med，1999，78(24):318-319.

［5］ Hu Y L，Wang Z X，Xiao W L. Studies on anti-anoxia and anti-epilepsy of Cyonmorium songaricum［J］. Shihezi University(Natural Sci)，2005，19 (3):302-303.

［6］ 温旭敏，魏 涛，白利萍，等. 川芎嗪对H2O2诱导PC12细胞凋亡的保护作用研究［J］. 中国药物与临床，2013，15(1):25-27.

［7］ Pari L 1，Murugavel P，Sitasawad S L，et al. Cytoprotective and antioxidant role of diallyl tetrasulfide on cadmium induced renal injury:an in vivo and in vitro study［J］. Life Sci，2007，80(16):650.

［8］ 张思巨，张淑运，扈继萍. 锁阳多糖的研究［J］. 中国中药杂志，2001，26(6):409-410.

［9］ 刘志明，唐彦君，吴海舟，等. 苯酚-硫酸法测定葡萄酒中总糖含量的样品处理［J］. 中国酿造，2011，2(27):158-161.

［10］ Wang Junlong，Zhang Ji，Wang Xiaofang，et al. A comparison study on microwave-assisted extraction of Artemisia sphaerocephala polysaccharides with conventional method:Molecule structure and antioxidant activities evaluation［J］. In J Biol Macromol，2009，45(25):483-492.

［11］ 宋 珅，赵宝堂，殷振雄，等. 籽瓜多糖的提取分离及单糖组成的GC-MS 分析［J］. 食品与发酵工业，2013，39(5):238-245.

［12］ 张 生，杨如娥，欧阳健明. 非洲绿猴肾上皮细胞的损伤模型及其对草酸钙生长的调控作用［J］. 化学学报，2011，13(69):284-290.

［13］ 耿金荣，程 刚. 肾脏疾病与氧自由基及抗氧化剂治疗研究进展［J］. 医师进修杂志，1995，23(7):53-57.

［14］ 彭 花，邓穗平，谈 金. 人类肾上皮细胞氧化损伤模型的建立［J］. 中国病理生理杂志，2012，11(1):66-69.

［15］ Chandra J，Samali A，Orrenius S. Triggering and modulation of apoptosis by oxidative stress［J］. Free Radic Biol Med，2001，29(4):323-333.