降血糖类保健食品中非法添加的8 种药物检测及实例分析

黄湘鹭，王静文，曹 进，张庆生

（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

降血糖类保健食品中非法添加的8 种药物检测及实例分析

黄湘鹭，王静文，曹 进，张庆生

（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

目的：建立检测降血糖类保健食品中非法添加8 种药物的方法并用于实际检测。方法：采用高效液相色谱-串联质谱法，以ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色谱柱，以0.1%甲酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱。通过分子离子峰、二级碎片、色谱保留时间等信息，对宣称辅助降血糖类保健食品非法添加8种化学药物进行鉴别和定量测定。结果：8种药物实现了同时分离与专属鉴定，检出限为5.5～76 ng/g，精密度为0.22%～1.19%，回收率为74.0%～111.9%；本法适用于硬胶囊样品；利用本法，从15 批样品中检测出9 批含非法添加化学药物。结论：本方法专属性强、灵敏度高，结果准确可靠，可作为宣称辅助降血糖类保健食品中检测非法添加化学药物的方法参考。

高效液相色谱-串联质谱法；降糖药物；格列本脲；西地那非

随着人们生活水平的提高和对健康品质的需求，保健食品由于可以补充人们所需营养成分、修复人体部分亚健康状态，而越来越多的被人们使用。由于保健食品是具备一种功效或者宣称功能的食品[1]，因此，在日常使用中，常被人们误认为具备治疗效果，而和某些病症状态的恢复相联系，为了凸显这些作用，换取更大的经济利益，许多不法分子在保健食品中添加有关药物以增加保健食品的功效显示[2-4]。在一个时期的实际检验中发现，保健食品中非法添加化学药物主要存在功能对应的治疗药物的添加、药物副作用与功能对应的药物添加等选择方向，在添加形式上，存在一种或者多种药物添加、药物前体添加或者药物衍生物添加等。由于保健食品中非法添加药物存在剂量不明确、种类不清晰、物质相互作用不确切等风险，因此保健食品中非法添加药物这种现象具有很强的潜在危害性，是影响食品安全的重要危害来源，需要严厉打击[5]。在前期保健食品相关检测中发现，部分降血糖类保健食品在非法添加降糖类药物的同时，还添加了部分可用于抗疲劳的药物，这为保健食品中非法添加药物的危害溯源和风险鉴别提供了新的线索。因此，这里选择常见降血糖药物和壮阳类药物共8种进行研究，包括磺脲类降糖药（格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲）、非磺脲类降糖药（瑞格列奈）和5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5，PDE5）抑制剂（西地那非、他达拉非）。本实验建立了高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MSMS）法，可快速、准确地检测宣称辅助降血糖类保健食品中8种药物，为拓展降血糖类保健食品中非法添加化学药物的筛查范围提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

格列吡嗪（纯度9 9.5%）、格列齐特（纯度99.9%）、瑞格列奈（纯度99.7%）、格列本脲（纯度100%）、格列美脲（纯度99.1%）、格列喹酮（纯度99.9%） 中国食品药品检定研究院；西地那非（纯度100%） Toronto Research Chemicals；他达拉非（纯度100%）振翔公司；甲醇（色谱纯） 德国Merck公司；甲酸（色谱纯） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

6460 Triple Quad LC-MS配有电喷雾离子源 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Z O R B A X E c l i p s e P l u s C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温：35℃；以0.1%甲酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱：0→5 min，A 90%→90%；5→5.1 min，A 90%→10%；5.1→10 min，A 10%→10%；10→10.1 min，A 10%→90%；10.1→13 min，A 90%→90%；流速0.1 mL/min；进样量1 øL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源，毛细管电压3 500 V，喷雾电压500 V，雾化气30 psi，气流速度8 L/min，气流温度330 ℃，鞘气流速11 L/min，扫描方式为多反应监测（multiplereactionmonitoring，MRM），正离子模式。各化学药物监测离子对及质谱参数见表1。

表1 降糖类化学药物监测离子对及质谱参数Table1 MRM ions pair and MS parameters of anti-diabetics

1.3.3 对照品溶液的配制

精密称取格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齐特、瑞格列奈、格列本脲、西地那非、他达拉非适量，加甲醇溶解并制成每1 mL各含100 μg的对照品储备液。精密吸取各对照品储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品混合溶液。

1.3.4 供试品溶液的配制

称取0.5 g的硬胶囊样品至于50 mL离心管，加甲醇25 mL超声提取15 min，放冷至室温，加甲醇定容至刻度，混匀。离心后吸取上清液，过0.45 μm滤膜后待用。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

图1 8种化学药物的多反应监测离子流图Fig.1 MRM chromatograms of 8 drugs: gliquidone (a), glibenclamide (b), glimepiride (c), sildenafil (d), repaglinide (e), glipizide (f), tadalafil (g) and gliclazide (h)

本实验分别对甲醇-水、甲醇-20 mmol/L醋酸铵、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸-20 mmol/L醋酸铵系统进行了考察，结果以甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸-20 mmol/L醋酸铵系统作为流动相时效果较好，色谱峰峰形尖锐，分离效果好，基线稳定。为减少流动相配比数量，选择甲醇-甲酸作为流动相。图1为8种化学药物的多反应监测离子流图。

2.2 特征碎片离子的选择和质谱条件的优化

采用MRM模式对宣称辅助降血糖类保健食品非法添加化学药物进行分析。在电喷雾离子源正离子模式下，通过一级质谱扫描确定8 种化合物的[M+1]+准分子离子峰，通过子离子扫描对各化合物进行扫描，确定MRM模式下各特征碎片离子。8 种化合物的特征碎片离子见表1，每个化合物选择2～4 个离子对。

采用MassHunter Optimizer软件对8 种化合物的碎裂电压和碰撞能量进行优化，碎裂电压优化范围为50～150 V，碰撞能量为5～50 eV，优化结果见表1。

2.3 方法学考察

2.3.1 检出限及线性范围

取硬胶囊阴性样品0.5 g，分别加入一定量的对照品，按供试品溶液的配制方法同法配制，以3倍信噪比计算检出限，通过添加至相应质量浓度加标样品予以确证；精密吸取对照品混合溶液0.1、0.5、1、5、10 mL，分别置10 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，制成质量浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 ng/mL对照品工作溶液，以各组分定量离子的峰面积对其质量浓度进行线性回归，得到线性回归方程和相关系数，结果见表2。

表2 8种化学成分的检出限、线性范围、回归方程和相关系数Table2 Limit of detection (LOD), linear ranges, linear equations and correlation coefficients ( ) for 8 drugs

2.3.2 精密度实验

取100 ng/mL对照品工作溶液，重复进样6 次，按上述色谱质谱条件测定，格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齐特、瑞格列奈、格列本脲、西地那非、他达拉非的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.04%、1.19%、0.41%、0.62%、0.55%、0.22%、0.34%、1.03%。

2.3.3 重复性实验

精密称取1 号样品6份，每份0.5 g，按供试品溶液的配制方法同法配制并测定，计算格列美脲的平均含量为1 302.64 øg/g（RSD=3.23%），格列本脲的平均含量为46.38 øg/g（RSD=5.59%），西地那非的平均含量为1.48 øg/g（RSD=5.10%），他达拉非的平均含量为177.25 øg/g（RSD=1.63%）。

2.3.4 加标回收率实验

取硬胶囊阴性样品0.5 g，分别加入一定量的对照品，按供试品溶液的配制方法同法配制并测定加标回收率，测定结果见表3。

表3 加标回收率Table3 Spiked recoveries

2.4 样品测定

应用本法对市售15批宣称辅助降血糖保健食品中格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齐特、瑞格列奈、格列本脲、西地那非、他达拉非进行筛查，发现非法添加成分9批，其中单独添加3批，复合添加6批，结果见表4。

表4 样品含量测定Table4 Determination of 8 illegal drugs in real samples

3 讨 论

根据结果对市售辅助降血糖类保健食品的非法添加化学药品的情况进行初步分析。通过对市售15 批降糖类保健食品进行筛查，发现6 批样品添加格列本脲，1 批添加格列美脲，5 批添加西地那非，2 批添加他达拉非。在这15 批样品中，添加1 种降糖类化学药品的为3 批，2 种的为1批。添加1 种壮阳类化学药品的为3 批，2 种的为1 批。降糖类化学药品与壮阳类化学药品混合添加的有3 批。在定性鉴别的同时，利用MRM模式对检出的化学药品进行了定量。

上述检出的化学药品多为处方药，必须在医生的指导下服用。格列本脲为第二代磺酰脲类降糖药，作用强而持久，持续时间为12～24 h，用量过大会导致持久性低血糖反应，对人体造成危害[6-9]。西地那非和他达拉非属于PDE5的选择性抑制剂，能抑制体内环磷酸鸟苷的降解，从而加强性兴奋的阴茎勃起反应[10-13]，在宣称抗疲劳类保健食品中有非法添加情况。但测定结果中，多种品牌的降糖类保健食品中均含有西地那非、他达拉非，且剂量范围不等。有甚者，在降血糖保健食品中只添加壮阳药，如样品2、5、8号。除非药物的原料来自同一厂家，否则意外污染的可能性不大。

另外，糖尿病慢性并发症之一是阳痿[14-17]，PDE5抑制剂（多为西地那非）与降糖药（多为格列本脲）的联合使用，可以从多方面减轻糖尿病的症状，不法商家通过这种联合添加的方式来增加降糖类保健食品的疗效。部分阳痿患者（不管是否患有糖尿病）由于迫切想改善其症状，擅自服用宣称具有壮阳效果的保健食品，而这些保健食品中可能非法添加不同程度的降糖药，患者服用后导致了一系列降糖药引发的严重副作用（比如低血糖）[18-20]，这些情况提示了保健食品非法添加药物的一种新的筛查思路，即通过对疾病可能出现的临床症状进行分析，扩展具备具体功能的保健食品的筛查范围，这为严格控制保健食品的产品质量，打击非法添加具有重要的意义。

[1] 国家技术监督局. GB 16740—1997 保健(功能)食品通用标准[S]. 北京: 中国标准出版社, 1997.

[2] 荫士安, 王茵. 试论保健食品的安全性[J]. 中华预防医学杂志, 2006, 40(2): 141-143.

[3] 王兰明. 我国食品安全管理工作的现状与思考[J]. 食品科学, 2004, 25(7): 187-192.

[4] 孙鑫贵, 李春雨, 赵榕. 保健食品违法添加药物状况及管理对策[J].首都公共卫生, 2010, 4(4): 153-155.

[5] 董永成, 杜士明, 陈永顺, 等. 中成药及保健品非法添加化学成分的类型, 危害及对策[J]. 时珍国医国药, 2006, 17(8): 1601-1602.

[6] 汤文璐, 王永铭, 杜文民. 国内42年文献源抗糖尿病药物的不良反应分析[J]. 中国新药与临床杂志, 2002, 21(12): 753-758.

[7] 柯俊, 汤文璐. 2006—2010年上海市口服抗糖尿病药物的不良反应报告分析[J]. 中国临床药学杂志, 2011, 20(6): 351-356.

[8] TURNER R C, HOLMAN R R, CULL C A, et al. Intensive bloodglucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes (UKPDS 33)[J]. Lancet, 1998, 352: 837-853.

[9] 陈婕. 口服抗糖尿病药物不良反应报告分析[J]. 海峡药学, 2012, 24(3): 250-250.

[10] BOOLELL M, ALLEN M J, BALLARD S A, et al. Sildenafil: an orally active type 5 cyclic GMP-specific phosphodiesterase inhibitor for the treatment of penile erectile dysfunction[J]. International Journal of Impotence Research, 1996, 8(2): 47-52.

[11] RENDELL M S, RAJFER J, WICKER P A, et al. Sildenafil for treatment of erectile dysfunction in men with diabetes[J]. Journal of the American Medical Association, 1999, 281(5): 421-426.

[12] 郭应禄, 朱积川, 潘天明, 等. 口服西地那非治疗勃起功能障碍疗效和安全性的临床研究[J]. 中华泌尿外科杂志, 2001, 22(7): 389-394.

[13] 沈周俊, 余燕岚. 型磷酸二酯酶抑制剂治疗勃起功能障碍的疗效和安全性[J]. 中华男科学杂志, 2005, 11(8): 631-634.

[14] DEY J, SHEPHERD M D. Evaluation and treatment of erectile dysfunction in men with diabetes mellitus[J]. Mayo Clinic Proceedings, 2002, 77(3): 276-282.

[15] ALBERTI K, ZIMMET P Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus. Provisional report of a WHO Consultation[J]. Diabetic Medicine, 1998, 15(7): 539-553.

[16] HAKIM L S, GOLDSTEIN I. Diabetic sexual dysfunction[J]. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America, 1996, 25(2): 379-400.

[17] 朱禧星. 现代糖尿病学[M]. 上海: 上海医科大学出版社, 2000: 361-366.

[18] DALAN R, LEOW M K S, GEORGE J, et al. Neuroglycopenia and adrenergic responses to hypoglycaemia: insights from a local epidemic of serendipitous massive overdose of glibenclamide[J]. Diabetic Medicine, 2009, 26(1): 105-109.

[19] POON W T, LAM Y H, LEE H H, et al. Outbreak of hypoglycaemia: sexual enhancement products containing oral hypoglycaemic agent[J]. Journal of Medical Microbiology, 2009, 15(3): 196-200.

[20] 邓正照, 李琳, 卢齐, 等. 非法壮阳药与低血糖[J]. 中国糖尿病杂志, 2011, 19(2): 83-84.

Determination of 8 Drugs in Antidiabetic Supplements: A Case Study

HUANG Xiang-lu, WANG Jing-wen, CAO Jin, ZHANG Qing-sheng
(National Institutes of Food and Drug Control, Beijing, 100050, China)

Objective: To develop and apply a method for the identification of 8 illegal drugs in antidiabetic supplements using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS). Methods: The chromatography was performed using a ZORBAX Eclipse Plus C18column (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm), with a mobile phase consisting of 0.1% (V/V) formic acid (phase A) and methanol (phase B) by gradient elution. Eight illegal synthetic drugs (gliquidone, glibenclamide, glimepiride, sildenafil, repaglinide, glipizide, tadalafil and gliclazide) added in antidiabetic health foods were determined qualitatively and quantitatively based on the information of molecular ion mass, specific fragment ions and chromatographic retention. Results: Eight drugs could be separated and identified simultaneously. The limits of detection (LODs) of these substances were in the range of 5.5–76 ng/g, the precision expressed as relative standard deviation (RSD) for six replicate determinations was 0.22%–1.19%, and the recoveries from spiked samples were in the range of 74.0%–111.9%. The method was suitable for hard capsules. In the 15 batches of samples, the illegal synthetic drugs were found in 9 batches. Conclusion: The method has been proved to be simple, sensitive and accurate, and can be used as a reference in the detection of the illegal synthetic drugs in anti-diabetic supplements.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS); antidiabetics; glibenclamide; sildenafil

R917

A

1002-6630（2014）10-0149-04

10.7506/spkx1002-6630-201410027

2013-09-12

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAK08B02）

黄湘鹭（1985—），女，助理研究员，硕士，研究方向为食品、保健食品及化妆品的检测。E-mail：xianglu_huang@126.com