神经营养因子对喉返神经损伤再生的研究进展△

王保鑫 董频

喉返神经(recurrent laryngeal nerve)损伤多是由于颈部外伤或手术误伤所致，如甲状腺手术、喉部手术等，均可引起不同程度喉功能和神经功能障碍［1］。目前声带麻痹修复术，如喉返神经移植修复术［2］、自体静脉移植桥接术［3］等，虽然取得了一定的临床效果，但术后神经功能的恢复往往不完全。Dong等［4-6］在家狗身上成功进行自体和异体的全喉移植，并对神经、肌肉的变化进行初步研究，发现喉功能得到比较好的恢复，但神经功能的恢复不完全，这表明周围神经的再生与功能的恢复不仅需要完善的手术，还依赖于局部的微环境。

喉返神经损伤后，再生的轴突数目不足及功能恢复不佳是影响喉功能恢复的重要原因［7］。应用神经营养因子(neurotrophin)等生物活性因子促进神经轴突的再生，近年来已成为周围神经损伤修复研究中的一项重要突破。

神经营养因子是指机体产生的能够促进神经细胞存活、生长、分化的一类蛋白质因子。它不仅可以减少神经变性，阻止疾病进程，而且还具有刺激轴突生长、促进再生的功能［8］。神经营养因子主要包括神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胶质细胞源性神经生长因子(glial cell line-derived neurotrophic growth factor，GDNF)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、神经营养蛋白-3(neurotrophin-3，NT-3)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)等。研究表明，对于阿尔茨海默病［9-10］、帕金森病［11］、亨廷顿病［12］、肌萎缩性侧索硬化症［13］、卒中［14］、脊髓损伤［15］和外周神经病变［16］等，神经营养因子表现出能促进神经元的修复、轴突生长和功能性恢复的作用。本文就神经营养因子对喉返神经损伤的再生作一综述。

1 NGF

NGF是由Levi-Montalcini［17］在1951年首先发现的，是最早发现的神经营养因子，也是迄今为止研究得最清楚的一个神经营养因子。NGF主要分布于神经靶细胞，如中枢的神经胶质细胞，外周的施万细胞、骨骼肌及一些腺体。有报道［18-19］从不同动物的不同组织、器官及人的体液，如唾液、血清、尿液等中分离、纯化出NGF，这些研究表明NGF可以由不同来源的细胞分泌，而不仅仅由神经细胞分泌。NGF通过与反应性神经元表面特异性受体结合而起作用，其活性由2个受体蛋白TrkA和p75来调节［20］。Vega-Cordova等［21］通过免疫组织化学手段研究了兔单侧喉返神经损伤后，环杓后肌和甲杓肌中NGF、BDNF、NT-4的表达水平，并评估了神经再生情况。研究发现在喉返神经损伤4个月后，可见喉返神经末梢有强健的神经再生。而且3种神经营养因子不同时间点在甲杓肌和环杓后肌中的表达水平不同:①NGF在甲杓肌中的表达水平在损伤后3 d时显著下降，在6周时上升;在环杓后肌中3 d时不变，6周时上升。②BDNF在甲杓肌中的表达水平不变，但在环杓后肌中3 d和6周时均下降，在4个月时表达水平接近正常水平。③NT-4在甲杓肌中3 d时上升，6周时下降;在环杓后肌中3 d时下降，6周时上升。

2 BDNF

BDNF是第二个被发现的神经营养因子家族成员，它是由Barde等［22］于1982年从猪脑的提取物中分离得到的，主要在中枢神经系统特别是皮质和海马中合成，其基本功能是促进神经元存活和轴突生长［23］，生理作用至少涉及维持发育及成年神经元存活，营救损伤神经元，促进神经再生及突触重建，参与胶质细胞损伤，改进神经行为学，以及参与神经疼痛调节等［24］。Moro等［25］通过免疫组织化学、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法探究了喉返神经或迷走神经损伤后，重组腺病毒载体鼠BDNF基因(AxCAmBDNFME)和重组腺病毒载体人GDNF基因(AxCAhGDNF)的协同作用。研究发现，应用AxCAmBDNFME或AxCAhGDNF转染组治疗神经损伤后，编码BDNF或GDNF的mRNA和蛋白质表达水平明显高于对照组，且AxCAmBDNFME转染组疗效高于AxCAhGDNF组;当两者同时用于治疗时，效果明显高于单一治疗组。

3 GDNF

GDNF是1993年在大鼠胶质B49细胞中发现而得名［26］，它可以减少喉返神经损伤后脑干及疑核中运动神经元的损害和丧失，并且可以抑制一氧化氮合酶(NOS)，从而起到阻止损伤神经的退化变性［27］。Araki等［28］通过大鼠喉返神经急性损伤模型研究发现，喉返神经损伤后，将 GDNF编码基因(AxCAhGDNF)注射导入损伤位点，通过X-Gal和GDNF免疫组织化学及RT-PCR研究发现，在脑干和疑核的神经组织中GDNF mRNA的表达明显高于对照组，同时喉返神经的传导速度显著提高，神经轴突直径增大，髓鞘再生显著，且声带运动在损伤后2～4周便得到恢复。Shiotani等［29］建立兔喉返神经挤压伤模型，通过腺病毒载体将GDNF基因导入喉返神经纤维内，2周、4周时观察发现喉返神经传导速度显著提高，声带运动得到更好的恢复。张贤等［30］探讨长期失喉返神经支配后，人环杓后肌GDNF及其受体GDNFR-1的变化规律。结果显示失神经支配1年内环杓后肌GDNF和GDNFR-1表达水平较高，失神经支配1～2年内环杓后肌GDNF和GDNFR-1仍有表达，说明失神经支配2年内喉肌GDNF的功能状态较好，此期间进行神经修复，能获得较好的肌肉功能恢复，这与临床神经修复效果的时限相吻合。

4 CNTF

CNTF是1979年Alder等［31］在虹膜、睫状体和脉络膜中发现的维持睫状神经生存的物质，为酸性蛋白分子。CNTF在外周神经系统中分布最多，主要来自于髓鞘施万细胞的胞质以及睫状神经节、脊神经节和交感神经节。郑宏良等［32］探讨了CNTF对喉返神经再生的趋向作用。通过建立犬单侧喉返神经损伤模型，术后做喉镜、神经电生理学检查，末次检查后做辣根过氧化物酶逆行追踪、神经组织学及超微结构观察，发现应用CNTF治疗后，犬恢复生理性声带运动功能及再生神经纤维数量、直径、髓鞘厚度均明显多于或大于对照组，表明CNTF对周围神经有促进运动神经纤维再生的作用，对运动神经轴突的再生有趋向性。Halum等［33-34］建立兔单侧喉返神经损伤模型，应用分别浸润有10-5mol/L的心脏毒素、100 μg/mL的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、50 μg/mL的CNTF和生理盐水的自体肌肉干细胞移植修复神经损伤，结果显示CNTF和IGF-1浸润组对肌肉干细胞的存活最有利，相应形成的肌纤维也最粗，表明CNTF和IGF-1不仅能促进神经再生，而且能提高肌肉干细胞存活率，应用CNTF和(或)IGF-1浸润肌肉干细胞是一种治疗喉返神经损伤的有效方法。

5 NT-3

NT-3是在1990年由Ernfors等［35］发现，是一种小分子量的碱性蛋白质，与NGF及 BDNF高度同源，功能上相互关联。NT-3不仅能促进体内受损神经元和神经胶质细胞的存活，而且还能诱导体外培养的细胞向神经细胞分化;同时，NT-3还可促进轴突的再生及髓鞘化，并且对轴突的生长具有导向作用［36］。Kingham等［37］建立猪喉返神经损伤模型，探究了采用膈神经移植复合NT-3再生环杓后肌的疗效。结果显示，膈神经移植复合NT-3显著提高了膈神经再生，但对环杓后肌纤维再生只有很小的促进作用，表明膈神经移植复合其他神经营养因子或联合应用NT-3修复喉返神经损伤的探索是可行的。

6 HGF

HGF最早于1984年从肝切除术后的残余肝组织中发现，因其可刺激肝细胞合成DNA而命名为HGF。HGF广泛分布于全身各组织器官，是一种多效性神经营养因子，具有多种功能。已有研究证实对中枢神经系统有保护作用［38］，在坐骨神经［39］、面神经［40］等周围神经损伤后，局部给予外源性HGF对神经元有保护作用，并对轴突再生和诱向生长具有促进作用。李孟等［41］通过建立犬单侧喉返神经损伤动物模型后，用聚乳酸聚羟基乙酸共聚物［poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA］管桥接喉返神经断端，并在局部应用外源性HGF，观察其对受损喉返神经再生及功能恢复的作用。结果发现:①术后HGF组声带恢复运动早，且运动幅度明显大于对照组。②术后各时间点HGF组与对照组喉返神经电生理检查结果相比较，HGF组自发肌电图、诱发电位幅度明显增大，潜伏期明显缩短。③HGF组有髓再生神经纤维数、神经纤维的直径及髓鞘的厚度均明显大于对照组。④电镜观察显示HGF组的再生神经纤维超微结构形态接近正常，而对照组形态与正常差异较大，可见较多的无髓神经纤维。研究表明喉返神经损伤后，应用外源性HGF对其再生有明显的促进作用。

7 展望

喉返神经损伤致声带麻痹是临床上常见的疾病之一，尽管喉返神经修复治疗单侧声带麻痹已取得令人鼓舞的效果，但长期损伤，修复后的神经功能恢复仍不理想。神经轴突的生长能力主要依赖于轴突周围的微环境，而非其内在特性，神经营养因子等是构成周围微环境的主要来源。研究证实应用外源性神经营养因子，如 NGF［21］、BDNF［25］、GDNF［28］等可促进神经轴突的生长，并有助于维持运动神经元的功能。但上述神经营养因子对神经轴突和神经元保护作用的局限性导致其单独应用往往不能取得理想的效果，因为长期失神经后的肌肉萎缩和纤维化使得神经、肌肉再生的微环境不理想，从而阻碍了神经功能的理想恢复。有研究［42-44］结果提示，给予2种或2种以上神经营养因子都可以不同程度提高受损神经的修复能力，因此，研究将2种或2种以上神经营养因子共同修复受损喉返神经，观察是否具有协同放大作用，并深入研究其作用机制是今后研究的方向之一。

外源性营养因子的给药途径和方法研究甚多，有效地神经营养因子浓度及持续作用时间可以更有效地维持运动神经元的存活，促进运动神经元轴突的再生［45］。目前通常采用局部注射神经营养因子，但此方法作用不持久，效果不显著，且易并发副作用。如果能在受损部位精确有效地调控神经营养因子的释放将比广泛弥漫干预更加安全有效。有研究证实，在面神经、脊神经、坐骨神经损伤模型中，应用载体负载神经营养因子植入损伤部位，术后神经功能的恢复明显优于系统给药组［46-50］。因此，如何在局部使神经营养因子通过缓释作用于喉返神经损伤部位，既保持局部持续稳定的药物浓度，又避免因药物全身吸收所带来的不良反应，有待于进一步研究。探究将神经营养因子负载到合适的载体，构建药物缓释系统，使神经营养因子在局部达到持续稳定释放，以此来促进喉返神经再生，有望成为今后的研究热点。

此外，通过检索中外文献发现，神经营养因子对喉返神经损伤再生的研究较少。伴随基础研究的深入和临床喉返神经修复技术的拓展，今后此方面研究将获得更大的发展空间。积极而慎重地开展神经营养因子对喉返神经损伤再生的基础和临床研究，将大大推动治疗喉返神经损伤和其他神经系统疾病的研究进程。

［1］Hayward NJ，Grodski S，Yeung M，et al.Recurrent laryngeal nerve injury in thyroid surgery:a review［J］.ANZ J Surg，2013，83(1-2):15-21.

［2］Blumin JH，Merati AL.Laryngeal reinnervation with nerve-nerve anastomosis versus laryngeal framework surgery alone:a comparison of safety［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2008，138(2):217-220.

［3］吕新生，李新营，王志明.自体静脉移植桥接修复喉返神经缺损的疗效［J］.中华普通外科杂志，2004，19(9):526-527.

［4］Dong P，Li X，Wang G，et al.Repair with sternohyoid muscle fascia after subtotal laryngectomy［J］.J Laryngol Otol Suppl，2009，123(31):18-23.

［5］Dong P，Li X，Xie J，et al.Modified frontolateral partial laryngectomy without tracheotomy［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2009，141(1):70-74.

［6］Jiang Y，Dong P，Li N，et al.Laryngeal allotransplantation by stages in beagles:an initial study［J］.Transplant Proc，2011，43(7):2733-2736.

［7］Rubin AD，Hogikyan ND，Oh A，et al.Potential for promoting recurrent laryngeal nerve regeneration by remote delivery of viral gene therapy［J］.Laryngoscope，2012，122(2):349-355.

［8］Levi-Montalcini R.The nerve growth factor 35 years later［J］.Science，1987，237(4819):1154-1162.

［9］Singh S，Kushwah AS，Singh R，et al.Current therapeutic strategy in Alzheimer＇s disease［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012，16(12):1651-1664.

［10］Boiocchi C，Maggioli E，Zorzetto M，et al.Brain-derived neurotrophic factor gene variants and Alzheimer disease:an association study in an Alzheimer disease Italian population［J］.Rejuvenation Res，2013，16(1):57-66.

［11］Kells AP，Forsayeth J，Bankiewicz KS.Glial-derived neurotrophic factor gene transfer for Parkinson＇s disease:anterograde distribution of AAV2 vectors in the primate brain［J］.Neurobiol Dis，2012，48(2):228-235.

［12］Zuccato C，Marullo M，Vitali B，et al.Brain-derived neurotrophic factor in patients with Huntington＇s disease［J］.PLoS One，2011，6(8):e22966.

［13］Yanpallewar SU，Barrick CA，Buckley H，et al.Deletion of the BDNF truncated receptor TrkB.T1 delays disease onset in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis［J］.PLoS One，2012，7(6):e39946.

［14］Kim JM，Stewart R，Park MS，et al.Associations of BDNF genotype and promoter methylation with acute and long-term stroke outcomes in an East asian cohort［J］.PLoS One，2012，7(12):e51280.

［15］Del Gaizo DJ，Regan CM，Graff RD，et al.The effect of methylprednisolone intravenous infusion on the expression ofciliary neurotrophic factor in a rat spinal cord injury model［J］.Spine J，2013，13(4):439-442.

［16］Saleh A，Roy Chowdhury SK，Smith DR，et al.Ciliary neurotrophic factor activates NF-κB to enhance mitochondrial bioenergetics and prevent neuropathy in sensory neurons of streptozotocin-induced diabetic rodents［J］.Neuropharmacology，2013，65:65-73.

［17］Levi-Montalcini R.The nerve growth factor［J］.Ann N Y Acad Sci，1964，118:149-170.

［18］Lipps BV.Isolation of subunits，alpha，beta and gamma of the complex taipoxin from the venom ofAustralian taipan snake(Oxyuranus s.scutellatus):characterization of beta taipoxin as a potent mitogen［J］.Toxicon，2000，38(12):1845-1854.

［19］Lipps BV.Isolation of nerve growth factor(NGF)from human body fluids;saliva，serum and urine:comparison between cobra venom and cobra serum NGF［J］.J Nat Toxins，2000，9(4):349-356.

［20］Manca A，Capsoni S，Di Luzio A，et al.Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(6):2009-2014.

［21］Vega-Cordova X，Cosenza NM，Helfert RH，et al.Neurotrophin expression of laryngeal muscles in response to recurrent laryngeal nerve transection［J］.Laryngoscope，2010，120(8):1591-1596.

［22］Barde YA，Edgar D，Thoenen H.Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain［J］.EMBO J，1982，1(5):549-553.

［23］Galko MJ，Tessier-Lavigne M.Function of an axonal chemoattractant modulated by metalloprotease activity［J］.Science，2000，289(5483):1365-1367.

［24］王廷华，刘进.深入认识BDNF在脑脊髓损伤修复中的作用，加强转化医学研究［J］.四川大学学报(医学版)，2012，43(2):226-230.

［25］Moro K，Shiotani A，Watabe K，et al.Adenoviral gene transfer of BDNF and GDNF synergistically prevent motoneuron loss in the nucleus ambiguus［J］.Brain Res，2006，1076(1):1-8.

［26］Lin LF，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF:a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons［J］.Science，1993，260(5111):1130-1132.

［27］Saito K，Shiotani A，Watabe K，et al.Adenoviral GDNF gene transfer prevents motoneuron loss in the nucleus ambiguus［J］.Brain Res，2003，962(1-2):61-67.

［28］Araki K，Shiotani A，Watabe K，et al.Adenoviral GDNF gene transfer enhances neurofunctional recovery after recurrent laryngeal nerve injury［J］.Gene Ther，2006，13(4):296-303.

［29］Shiotani A，Saito K，Araki K，et al.Gene therapy for laryngeal paralysis［J］.Ann Otol Rhinol Laryngol，2007，116(2):115-122.

［30］张贤，郑宏良，陈世彩.长期失喉返神经支配患者环杓后肌GDNF及其受体GDNFR-1变化的研究［J］.听力学及言语疾病杂志，2008，16(6):470-472.

［31］Adler R，Landa KB，Manthorpe M，et al.Cholinergic neurotrophic factors intraocular distribution of trophic activity for ciliary neurons［J］.Science，1979，204(4400):1434-1436.

［32］郑宏良，何成，周水淼，等.外源性睫状神经营养因子对喉神经再生的趋向作用［J］.中华耳鼻咽喉科杂志，2002，37(5):333-337.

［33］Halum SL，Hiatt KK，Naidu M，et al.Optimization of autologous muscle stem cell survival in the denervated hemilarynx［J］.Laryngoscope，2008，118(7):1308-1312.

［34］Halum SL，McRae B，Bijangi-Vishehsaraei K，et al.Neurotrophic factor-secreting autologous muscle stem cell therapy for the treatment of laryngeal denervation injury［J］.Laryngoscope，2012，122(11):2482-2496.

［35］Ernfors P，Wetmore C，Olson L，et al.Identification of cells in rat brain and peripheral tissues expressing mRNA for members of the nerve growth factor family［J］.Neuron，1990，5(4):511-526.

［36］Kamei N，Tanaka N，Oishi Y，et al.BDNF，NT-3，and NGF released from transplanted neural progenitor cells promote corticospinal axon growth in organotypic cocultures［J］.Spine，2007，32(12):1272-1278.

［37］Kingham PJ，Hughes A，Mitchard L，et al.Effect of neurotrophin-3 on reinnervation of the larynx using the phrenic nerve transfer technique［J］.Eur J Neurosci，2007，25(2):331-340.

［38］Gusenbauer S，Vlaicu P，Ullrich A.HGF induces novel EGFR functions involved in resistance formation to tyrosine kinase inhibitors［J］.Oncogene，2013，32(33):3846-3856.

［39］Xu L，Zhou S，Feng GY，et al.Neural stem cells enhance nerve regeneration after sciatic nerve injury in rats［J］.Mol Neurobiol，2012，46(2):265-274.

［40］Esaki S，Kitoh J，Katsumi S，et al.Hepatocyte growth factor incorporated into herpes simplex virus vector accelerates facial nerve regeneration after crush injury［J］.Gene Ther，2011，18(11):1063-1069.

［41］李孟，陈世彩，陈东辉，等.肝细胞生长因子对喉返神经损伤后再生的作用［J］.听力学及言语疾病杂志，2012，20(5):467-471.

［42］陈菁，陈建梅，楚燕飞，等.NGF、CNTF和GDNF对感觉和运动神经元的协同作用研究［J］.神经解剖学杂志，2006，22(5):535-541.

［43］Ghitza UE，Zhai H，Wu P，et al.Role of BDNF and GDNF in drug reward and relapse:a review［J］.Neurosci Biobehav Rev，2010，35(2):157-171.

［44］Pg S，B L，M S，et al.GDNF and BDNF gene interplay in chronic tinnitus［J］.Int J Mol Epidemiol Genet，2012，3(3):245-251.

［45］于雯雯，蒋欣泉，张志愿.周围神经导管修复中神经营养因子的应用方式进展［J］.中国口腔颌面外科杂志，2009，7(1):77-80.

［46］Hato N，Nota J，Komobuchi H，et al.Facial nerve decompression surgery using bFGF-impregnated biodegradable gelatin hydrogel in patients with Bell palsy［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2012，146(4):641-646.

［47］Esaki S，Kitoh J，Katsumi S，et al.Hepatocyte growth factor incorporated into herpes simplex virus vector accelerates facial nerve regeneration after crush injury［J］.Gene Ther，2011，18(11):1063-1069.

［48］Stanwick JC，Baumann MD，Shoichet MS.Enhanced neurotrophin-3 bioactivity and release from a nanoparticle-loaded composite hydrogel［J］.J Control Release，2012，160(3):666-675.

［49］Takagi T，Kimura Y，Shibata S，et al.Sustained bFGF-release tubes for peripheral nerve regeneration:comparison with autograft［J］.Plast Reconstr Surg，2012，130(4):866-876.

［50］Hou S，Nicholson L，van Niekerk E，et al.Dependence of regenerated sensory axonson continuousneurotrophin-3 delivery［J］.J Neurosci，2012，32(38):13206-13220.