大鼠胰腺星状细胞分离培养与鉴定

崔立华，张淑坤，崔乃强，夏亚飞，许大辉

1.天津市中西医结合急腹症研究所（天津300100）

2.天津市南开医院肝胆胰外科（天津300100）

3.天津市南开医院药学科（天津300100）

纤维化是慢性胰腺炎的典型病理特征，活化的胰腺星状细胞（pancreatic stellate cell，PSC）是胰腺纤维化的主要效应细胞。PSC分离和成功培养是体外研究胰腺纤维化的重要前提。未活性化的PSC胞浆中富含维A脂滴，并表达desmin蛋白，活化后的PSC则表达α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）[1]。目前国内PSC的分离方法主要以组织块法为主[2-3]，我们参照Apte方法[4]并加以改动，酶消化后通过Nycodenz密度梯度离心成功分离出PSC，为开展胰腺纤维化研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠，体质量300～350 g，购自中国医学科学院放射医学研究所。链蛋白酶、DNase I、GBSS（Gey’s balanced salt solution）、兔抗大鼠α-SMA抗体、多聚赖氨酸均购自Sigma公司。兔抗大鼠desmin抗体购自Cell Signaling公司。胶原酶P购自Roche公司。Nycodenz购自Axis-Shield公司。DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司。SP试剂盒购自武汉BOSTER公司。油红O购自上海Solarbio公司。CO2细胞培养箱来自上海力康公司Heal Force。冷冻离心机来自湘仪H2050R。

1.2 方法

1.2.1 PSC分离与培养 采用体质量300 g左右雄性Wistar大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，备皮，消毒。沿腹部正中线开腹，沿十二指肠无菌取出胰腺。PBS洗涤2次，将胰腺剪碎成1～2 mm3的小块，用含0.02%链蛋白酶，0.05%胶原酶P，0.1%DNase I的GBSS消化液37℃水浴消化20 min，消化后细胞悬液100μm滤网过滤，DMEM培养基洗涤，细胞重悬于9.5 mL含5%FBS的GBSS中，与8 mL 28.7%Nycodenz溶液混匀。轻轻加入6 mL含5%FBS的GBSS制成Nycodenz梯度，于4℃1400 g离心20 min，在Nycodenz与GBSS液面间的白色絮状的模糊带即为PSC。吸取细胞并用DMEM培养基洗2次，用含20%胎牛血清的培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数细胞成活率。将细胞接种于培养瓶中，第2 d换液成含10%FBS的培养基，以后隔天换液。

1.2.2 油红O染色 细胞弃去培养基后用PBS洗2次，加入4 mL 4%的中性甲醛固定30 min，水洗，60%的异丙醇浸洗，弃掉异丙醇，加入2 mL油红O工作液。在室温下孵育10 min，Mayer苏木精染核1 min，充分洗涤后显微镜下拍照。

1.2.3 免疫细胞化学染色 接种合适的密度进行细胞固定，加入10%的山羊血清进行封闭。分别加入1∶200稀释兔抗大鼠desmin一抗，单克隆α-SMA一抗，4℃过夜（PBS代替一抗作阴性对照）。加入IgG-HRP作用30 min。DAB显色，苏木精复染。以细胞浆内出现黄、棕色颗粒为阳性细胞。

1.2.4 细胞生长曲线 采用第一代的PSC进行接种，细胞消化后用血球计数板进行计数以20 000个细胞/孔接种于6孔板。连续6 d进行细胞计数，每天对3个孔进行计数，每个孔计数4次，并取平均值，绘制生长曲线。

2 结果

2.1 细胞形态 新鲜分离的PSC成活率达90%，每只大鼠胰腺组织获得活细胞约为8×105个。刚分离出的PSC呈圆形，胞质透亮，胞核较大且明显。接种24 h后大多数细胞已经贴壁，细胞晕明显，部分细胞伸出突起呈单角状外观，高倍镜下可见胞浆中有脂滴样结构。48 h后，大多数细胞呈角状外观，胞浆饱满。培养4～5 d后细胞约80%融合，可以进行传代培养。第2、3代细胞呈多角状生长，细胞核明显，胞浆中可见明显纤维丝结构。当细胞传至第4、5代，胞质核比显著增大，细胞生长速度缓慢，立体感变差（图1）。

图1 体外培养PSC形态学观察

2.2 油红O染色 细胞在24 h，48 h，72 h均可在99%以上的细胞胞浆中看到几个到十几个明显的红色至橙红色颗粒，呈串珠状，说明细胞中脂滴含量丰富，直到培养第6 d胞浆中仍有少量的橙红色颗粒，传代后脂滴消失(图2)。

图2 油红O染色（×400）

2.3 免疫细胞化学 培养的原代PSC细胞desmin免疫细胞化学染色观察，24 h大多数细胞可见胞质染成棕褐色，desmin表达阳性，培养48 h后desmin表达显著减弱，传代后基本不表达desmin。培养的原代PSC细胞α-SMA免疫细胞化学染色观察，24 h大多数细胞基本不表达α-SMA，培养48 h后多数细胞α-SMA表达阳性，传代后α-SMA阳性表达率接近100%(图3)。

图3 PSC免疫细胞化学染色（×400）

2.4 生长曲线 细胞接种后第1 d数量稍有下降，第2 d进入缓慢增长阶段，之后细胞数量增加明显，进入快速增长期。第5 d后细胞数量增加变慢，逐步进入平台生长期（图4）。

图4 PSC细胞生长曲线

3 讨论

PSC的细胞形态与肝星状细胞高度相似[5]。正常胰腺组织中PSC大约占所有胰腺细胞总数的3.99%[6]，如何得到纯度好、活力高的大量的PSC是一个关键问题。目前，PSC分离方法主要有组织块培养法和酶消化法两种，组织块法操作简便，但获得的细胞纯度和数量有限，长出的细胞为成纤维样与活化后的细胞无法鉴别。酶消化的方式有逆行胆胰管注射，胸主动脉插管法和直接酶消化法等[7-8]，前两种消化法消化的更充分，但操作技术难度大，需要大量的消化酶。直接酶消化法操作简单，通过消化时间控制消化程度。梯度离心剂的选择也各有不同，分别利用Nycodenz、Dextran和Percoll密度梯度离心方法分离了PSC，但报道的细胞产率和纯度不一[9-10]，Nycodenz对细胞的毒性更小，梯度离心剂的制备更简单。所以，我们采用直接酶消化法结合Nycodenz密度梯度离心，以期建立纯度高、重复性好的PSC分离培养方法。

密度梯度离心法分离PSC主要有两个步骤，酶消化和梯度离心。实验中要快速切取胰腺组织，避免组织自溶。消化过程要保持液体缓慢摇动，控制好消化时间。取出的细胞悬液要加入血清终止消化，避免长时间消化造成的细胞损伤。消化过程主要是采用胶原酶P、链蛋白酶和DNase I联合消化以获得PSC。胶原酶P对胰腺间质的消化较胰蛋白酶作用强,对细胞损伤较轻。链蛋白酶用于破坏胰腺上皮细胞，减少实质细胞对PSC的黏附。DNase I可以减轻腺泡细胞破坏后释放DNA所造成的细胞黏附聚集现象，这样大大提高了细胞产率与纯度。PSC富含脂滴,其平均密度在所有胰腺细胞中最低，位于Nycodenz与GBSS液之间的模糊带，吸取过程要小心谨慎，尽量不要吸取多余的液体防止腺泡等细胞的污染。

PSC具有静息态与激活态两种，并分别具有特异的标志物。静息状态PSC胞质内富含的维生素A脂滴可以被油红O染成红色，阳性表达desmin。激活态PSC阳性表达α-SMA。油红O染色发现，原代分离的细胞培养6 d，胞浆中仍可见明显的脂滴，传代后，橙红色的脂滴颗粒显著减少甚至消失。免疫细胞化学染色显示，细胞接种24 h仍然表达desmin，48 h后desmin基本不再表达。培养48 h后绝大多数细胞开始表达α-SMA，随着培养时间的增长和传代次数的增加，细胞表达α-SMA，而不再表达desmin，说明细胞活化。提示PSC接种24 h后即启动了激活过程，至培养第6 d大多数细胞激活，传代后细胞处于高度激活状态。

从细胞的生长曲线可以看出，细胞接种第1 d数量稍有下降，可能受贴壁情况的影响，因此细胞接种过程中要尽量快速、均匀，最大限度保持细胞的活力。接种3～5 d是细胞快速增殖的阶段，细胞的活力最好，相关细胞实验在此阶段进行，能真实、客观的反应细胞的状态。

相比较组织块法的分离方法，密度梯度离心通过细胞密度差异选择性的获得细胞的纯度较高。为了获得高活力的PSC，要严格控制酶消化的时间及酶的浓度，尽量缩短整个实验操作的时间。本实验中接种原代细胞的培养瓶经过0.1 mg/mL多聚赖氨酸处理，大大提高细胞贴壁率。本实验通过胶原酶、链蛋白酶联合法直接消化组织块，然后通过Nycodenz梯度离心分离大鼠PSC,细胞成活率达90%以上，每只大鼠胰腺组织获得活细胞约为8×105个，比插管注射消化法获得的细胞略少，但能满足实验需要。可见，此方法重复性好、细胞纯度高,为体外研究胰腺纤维化的机制提供了有力保障。

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