抗环瓜氨酸肽抗体检测新进展

赵瀛 黄斐 宋斌斌 郭玮 潘柏申

(复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因不明的系统性慢性自身免疫性疾病，主要临床特征为对称性、反复性多滑膜关节炎，最终可导致不可逆的骨关节损伤。RA的早期诊断、治疗对提高患者的生活质量和生存率有重要意义。1987年美国风湿病协会(American Rheumatism Association，ACR)首次制定了RA的诊断标准，包括临床表现、影像学特征以及类风湿因子(rheumatoid factor，RF)测定等方面，但是，RA患者在达到该标准时可能早已发生骨关节损伤。此外，RF也可见于其他自身免疫性疾病、慢性感染患者或老年人的血清中，因此其用于诊断RA的特异性较差。2009年ACR和欧洲抗风湿病联盟(The European League Against Rheumatism，EULAR)提出，将抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗体纳入RA的新的诊断标准中。

抗-CCP抗体是由RA患者的B淋巴细胞分泌的一种特异性较高的自身抗体，不仅可作为鉴别诊断RA与其他风湿病所致关节炎(痛)的指标[1-3]，还可作为判断RA患者骨关节损伤程度以及评估疗效的指标[4-5]。目前，在抗-CCP抗体的靶抗原、包被方式和固相载体、检测技术等方面都有了长足发展。

1 抗-CCP抗体特异性靶抗原

1998年，Schellekens等[6]研究发现，RA患者血清中的瓜氨酸肽是与自身免疫抗体结合的最主要的抗原决定簇，且聚角蛋白中富含的精氨酸的羧基端具有抗原性。由此，研究人员从人工合成的氨基酸序列中筛选出线性多肽，以此作为靶抗原。该靶抗原序列已知，可大量合成并纯化，而且分子量较小，与血清中其他成分的非特异性反应较少。但是，此类靶抗原的线性构象不稳定，可能产生“构象稀释”效应，导致检测结果偏低。

在抗原抗体复合物中，抗原肽常常以β-转角的构象形式存在。2000年，Schellekens等[7]以胱氨酸替代丝氨酸作为桥联介质，使线性瓜氨酸肽环化即转化为CCP，以此模仿自然的抗原决定簇，使其在溶液中的构象更为稳定；随后，他们通过Fmoc化学法固相合成含21个氨基酸序列的CCP，即第1代CCP(CCP1)，以CCP1作为靶抗原，采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测RA患者血清中的抗-CCP抗体；结果发现，与线性瓜氨酸肽比较，CCP诊断RA的灵敏度提高(68% 比 49%)，特异度为98%，但是CCP的灵敏度较RF略低[8]。2002年第2代CCP(CCP2)问世，CCP2是从RA患者的血清环瓜氨酸库中筛选出的不同系列、反应性较好、模拟真实构象的抗原肽[9]。CCP2的检测性能较CCP1好，CCP2诊断RA的灵敏度为64.4%～96%，已成为临床实验室中较为常用的抗原肽之一[10]。ELISA法检测显示，CCP2的诊断灵敏度(67.4%)高于CCP1(46.5)[11]。van Gaalen等[9]发现，CCP2不仅可用于诊断早期RA，还可以预测RA患者关节损伤的进展。CCP3是一种重组多肽，包含多种构象的瓜氨酸表位，从而增加了暴露位点，提高了对早期RA的免疫反应性[12]。dos Anjos等[13]对同一厂家生产的第2、3代抗-CCP抗体比较后发现，CCP3的诊断特异性与CCP2相似，但诊断灵敏度(82.9%)略高于CCP2(78.6%)。但是，也有文献[14]报道，Inova公司的CCP3与其他公司的CCP2相比并无明显优势，这可能与各厂家所用的抗原肽纯化技术不同而导致暴露的抗原决定簇存在差异有关。

2 包被方式和固相载体

固相化方式以及固相载体材料的选择对于抗原抗体的反应速率、洗涤分离以及灵敏度和线性范围的检测等具有重要意义。

2.1 包被方式 链霉亲和素包被一直是临床最常用的非共价包被方式。链霉亲和素与生物素间具有很强的结合能力，一个链霉亲和素可结合4个生物素分子，对目的分子的检测信号有放大作用。房国祥等[15]在ELISA的基础上建立了生物素-链霉亲合素系统检测抗-CCP抗体的方法，链霉亲和素预包被(SA/Bio-CCP)的固相化模式对RA的诊断灵敏度和特异度分别为69.4%和96.8%。由于链霉亲和素属于碱性糖蛋白，分子量较大，易与聚苯乙烯塑料微孔板表面结合，故链霉亲和素包被CCP不仅易将分子量较小的CCP固定于微孔板上，而且减小了反应过程中的空间位阻。但是，在这种非共价固相方式中，CCP的吸附较随意，且在吸附过程中CCP的分子结构可能发生改变，使功能部位无法暴露，影响CCP与抗体的结合。此外，由于CCP3为小分子多肽，其疏水区域极少，导致其不易充分吸附于SA/Bio-CCP模板的微孔上，易在洗涤过程中发生脱吸附现象。共价耦联固相法可以解决上述问题，从而提高了检测灵敏度。聚对二甲苯-H膜是甲酰基修饰的对二甲苯的聚合物，可以与蛋白质或多肽的伯胺基团反应，形成共价连接，其与CCP一步孵育后，二者可共价连接[16]。共价耦联法与非共价固相法的最低检出限分别为0.1 ng/mL及100 ng/mL，共价耦联法的固相化效率是非共价固相法的1000倍；根据两者的截断值(cut-off)，共价耦联法的灵敏度和特异度均高于非共价固相法[17]。

2.2 固相载体 聚苯乙烯为ELISA检测技术中的常用固相载体，这种固相载体材料的吸附表面平整，其包被和反应的表面积较小，使得抗原抗体的反应时间较长、检测速度较慢、线性范围较窄、易发生勾状效应。同时，由于抗原肽包被于聚苯乙烯表面且每一个反应孔(杯)只能检测一个固定项目，不利于高通量流水线自动化定量分析。因此，国内外开发了新型的固相载体材料来弥补以上缺陷，如表面微粒化酶标板、磁性微球。

磁性微球是国外应用的主要固相载体，它是通过适当的方法使有机高分子与无机磁性物质结合而形成的具有一定磁性及特殊结构的微球；可以通过共聚、表面改性等化学反应方法在微球表面引入多种反应性功能基团，磁性微球也可通过共价键结合生物活性物质，同时在外加磁场作用下，表现出强烈的磁响应性，可以进行快速分离。因此，磁性微球作为固相载体，具有快速分离、反应表面积大以及接近均相反应的优势，在一定程度上提高了检测灵敏度和效率。

3 抗-CCP抗体检测技术

随着免疫学研究的进展，抗-CCP抗体的检测技术也在不断改进，由传统的低通量、定性/半定量的检测技术向高通量、定量的检测技术发展，有效地提高了抗-CCP抗体的检测效率、检测性能以及临床应用价值。

3.1 定性检测技术

3.1.1 斑点免疫印迹法(dot immunobinding assay，DIBA) DIBA法是利用硝酸纤维素膜或乙酸纤维素膜作为固相支持物、进行抗原抗体反应的免疫学检测方法。虞伟等[18]用DIBA法检测抗-CCP抗体，并经方阵滴定法确定最佳实验条件；他们发现，DIBA法与欧蒙ELISA法检测结果的一致性尚可(Kappa=0.714)；DIBA法的特异度略高于ELISA法，但其灵敏度(52%)低于ELISA法(60.4%)，并且DIBA法检测抗-CCP抗体的稳定性及重复性难以控制，检测所需时间较长(2 h)。

3.1.2 胶体金免疫层析法(gold immunochromatography assay，GICA) GICA法是将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等相结合的固相免疫检测技术，其主要原理是将胶体金作为抗原示踪标记物，对检测样本中抗体的性质、含量进行分析。研究[19]显示，GICA法与欧蒙ELISA法对抗-CCP抗体的检测结果一致(Kappa=0.92～0.93)，总符合率为96.0%～97.3%；GICA法的灵敏度(84%)及特异度(98%)均较ELISA法高，且该方法操作简单，仅需5 min就可用肉眼观察结果，可用于快速筛查；但是，GICA法在实际应用中易受反应温度、湿度、加样量等因素影响。

3.2 定量检测技术 化学发光分析技术是临床常用的定量检测技术。该技术是将化学发光分析系统和免疫测定相结合而建立起来的一种痕量分析方法，因其具有灵敏度和特异度高、重复性好、检测范围宽、检测时间短、易于自动化等优势而成为临床常用的检测技术。目前，临床上主要通过化学发光酶免疫测定技术(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA)和电化学发光免疫测定技术(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)检测抗-CCP抗体。

3.2.1 CLEIA法 CLEIA法将碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等标记的抗原与样本中的抗体结合，加入发光剂，根据发光体系的发光强度进行抗-CCP抗体的测定。Tanaka等[20]采用CLEIA法与ELISA法检测抗-CCP抗体，发现CLEIA法对抗-CCP抗体的最低检测限为0.1 U/mL，为ELISA法的10倍；CLEIA法的整个检测过程仅需45 min；CLEIA法检测抗-CCP抗体的重复性、精密度、稳定性均优于ELISA法。近年来，有研究[21]评估了临床常用的Abbott公司全自动化学发光微粒子免疫检测法(chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA)对抗-CCP抗体的检测，结果显示，该方法的检测范围为0.95～194.6 U/mL；CMIA的受试者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲线下面积大于ELISA法，有较好的诊断性能；CMIA的最适cut-off值所对应的诊断灵敏度与特异度分别为84.1%和94.2%，与ELISA法相比，其总体符合率达99.48%；此外，用CMIA法检测抗-CCP抗体，可使其对RA的诊断性能优于RF或抗角蛋白抗体(anti-keratin antibody，AKA)等指标[22]。

3.2.2 ECLIA法 ECLIA法是用三联吡啶钌标记抗原，通过抗原抗体反应和磁珠分离，检测电极上三联吡啶钌发光强度，以此定量检测抗体。对ECLIA法的基本检测特性的评估显示，其批内和天间变异系数分别为0.9%～1.8%和1.7%～2.4%，回收率为96.7%～98.6[23]；ROC曲线分析显示，ECLIA法的诊断灵敏度为66.82%～75%，特异度为98.3%～98.7%。Cai等[24]将ECLIA法与欧洲诊断和欧蒙ELISA试剂盒进行比较，结果发现，ECLIA法与两种ELISA法的一致性和相关性均较好(Kappa>0.97；rs >0.85)。同时，ECLIA法的精确度及临床检测性能相对于2种ELISA法有所提高，且整个检测过程耗时较ELISA法短，更好地满足了临床需求。

3.3 新技术 20世纪90年代初，美国Luminex公司研发出一种高通量的新型生物分子检测技术，称为悬浮芯片技术(flexible multi-analyte profiling，xMAP)。该技术集流式技术、荧光微球、数字信号处理和传统化学技术为一体，将流式检测与芯片技术较好地结合，使生物芯片反应体系变为完全液相反应体系，也被称为液相芯片技术。近年来，该技术也被用于抗-CCP抗体检测[25]。

xMAP技术主要采用聚苯乙烯微珠，其内部标记有2种荧光染料，这2种荧光染料(各有10个浓度梯度)的不同配比产生100种不同编码的微球，将这些微球表面包被不同的探针，即可同时定量检测100种不同的抗体。分析时，依次加入目的分子和带有荧光的报告分子，不同的微球表面探针、目的分子与报告分子间特异性结合，形成了一个悬浮芯片系统。根据流式细胞术原理，将微球排成单列，使其快速通过检测通道，用2种激光进行检测。红色激光激发微球内部的荧光染料，检测器捕获信号，将不同微球进行分类，即定性分析；绿色激光激发微球上结合报告分子，确定报告分子的数量即定量分析。该系统只记录2种荧光同时出现的信号，不记录未结合的报告分子信号，所以检测过程中无需洗涤分离。

与ELISA法相比，xMAP的优点有：(1)吸样量少，一般为5 μL；(2)高通量，可以用一种试剂同时检测一个样本中的几十种不同的分子；(3)高敏感性[26]，xMAP技术的最低检出限(3.0 μg/mL)是ELISA法(1.5 μg/mL)的2倍；(4)线性范围宽[26]，xMAP技术的线性范围(0.06～1.7 μg/mL)比ELISA法(0.006～6.8 μg/mL)宽10倍；(5)重复性好，液相环境有利于保持检测分子的天然构象和活性，使结果更稳定。

然而，研究[27]发现，40%人类血清中存在能与微珠非特异性结合的抗体，这种抗体类似于免疫测定中的“异嗜性抗体”。微珠与此类抗体结合会引起很强的非特异性的背景，影响检测结果。Waterboer等[28]发现，用PVX(由聚乙烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮组成)或CBS-K试剂对血清进行预处理能大幅度地减少非特异性背景，而对特异性信号仅有微弱影响。

综上所述，抗原肽提纯、合成技术、固相技术以及检测系统的不断改进和高通量多元化新技术的引入提高了抗-CCP抗体的检测水平，缩短了检测时间，为RA的临床诊断、疗效监测、疾病活动预测等方面提供了更详细且准确的信息。

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