大马勃抗炎镇痛及体外抑菌作用的研究

张 帆，王大可，李爱欣，王淑敏*

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.公安边防广州指挥学校，广东 广州 510440)

大马勃抗炎镇痛及体外抑菌作用的研究

张 帆1,2，王大可1，李爱欣1，王淑敏1*

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.公安边防广州指挥学校，广东 广州 510440)

探讨大马勃子实体、菌丝体、发酵液不同提取物的抗炎、镇痛以及体外抑菌活性，为大马勃的进一步开发利用提供基础研究。实验结果显示，大马勃各部分提取物均能明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀度和对醋酸诱发的小鼠扭体反应，其中大马勃发酵液抗炎镇痛效果最佳，抑制率最高，分别为42.9%和43.69%；同时各种提取物均有不同程度的抑制作用，并且MIC最小值为3.15 mg·mL-1。结果表明大马勃子实体及液体发酵代谢产物具有明显的抗炎、镇痛及抑菌作用，本着合理利用资源，走工业化生产道路，可利用发酵代谢产物来代替大马勃子实体的相关临床作用。

大马勃提取物；抗炎作用；镇痛作用；体外抑菌活性

大马勃为常用食药用真菌,具有止血、清肺、解毒、消肿、利喉的功效。可治疗咳嗽、咽喉肿痛、失音、外伤出血。由于野生资源有限，本实验拟通过对大马勃子实体与发酵代谢产物的抗炎、镇痛、抑菌药理活性进行初步研究，为充分开发大马勃液体深层发酵的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

大马勃Calvatiagigantean(Batsch ex Pers)，其子实体、菌株、发酵菌丝、发酵液，均由长春中医药大学药用真菌研究所提供。金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、肠埃希氏菌Escherichiacoli、绿脓假单胞菌Pseudomonasaeruginosa均为长春中医药大学医学院微生物实验中心保藏的菌株。

1.1.2 药品和试剂

阿司匹林25 mg·片-1，石家庄康力药业有限公司(批号100933)；二甲苯(批号050510)，辽宁永强医药器械化玻有限公司试剂厂；地塞米松片0.75 mg·片-1，天津天药药业有限公司(批号H12020686)；冰醋酸(批号20090505)，北京化工厂；注射头孢药品(生产批号100702)，悦康药业集团有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.1.3 试验动物

昆明种小鼠共100只，雌雄兼有，清洁级，体重18 g～22 g，由长春生物制品研究所提供，动物合格证号：(吉)2006-0001。

1.1.4 试仪器

迴转式恒温调速摇瓶柜，上海新星自动化控制设备成套厂；101-1A型数显电热鼓风干燥箱，上海沪南科学仪器联营厂；超净工作台，苏州净化设备厂；YXQGO-280手提式高压蒸汽消毒器，丹东市日用五金厂；TG328A型电子分析天平，上海仪器公司；KQ-250DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；游标卡尺，规格(0～150) mm×0.02 mm，安徽桐城量具厂。

1.2 实验方法

1.2.1 抗炎、镇痛实验供试品的制备

大马勃子实体水提物：取大马勃干燥子实体50 g，加适量水超声提取2 h，将提取液浓缩至100 mL，备用(实验所用剂量均以生药计)。大马勃发酵液干粉水提物：取发酵液干粉50 g，加100 mL水溶解，过滤，备用。大马勃干燥菌丝体水提物：取干燥菌丝体100 g，方法同大马勃子实体提取[1]。

1.2.2 二甲苯致小鼠耳肿胀的试验

选择健康昆明种小鼠50只，雄性，随机分为5组，即模型组(生理盐水)、阿司匹林(0.2 g·kg-1)组、大马勃子实体水提物组(2.5 g·kg-1)、大马勃发酵液水提物组(2.5 g·kg-1)、大马勃菌丝体水提物组(5 g·kg-1)，每组10只，5组均连续灌胃给药7 d，模型组给予等体积的生理盐水。末次给药3 min后，于小鼠右耳前后两面均匀涂抹二甲苯0.02 mL·只-1，左耳不涂作为对照，45 min后脱颈处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，用直径为8 mm的打孔器分别在左右耳相同位置打下圆耳片，于电子天平上称取耳片重量，计算肿胀度和抑制率。肿胀度以每只小鼠左右耳片重量之差来表示，肿胀抑制率(P)用来比较各组动物耳肿胀差异[2]，公式为：

P=[(d-d1)d]×100%

式中：d表示模型组肿胀度；d1表示给药组肿胀度。

1.2.3 醋酸致小鼠的扭体试验

选用健康昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分组同“1.2.2”，阳性对照组为地塞米松(1.56 mg·kg-1)组，每组10只，5组均连续灌胃给药7 d，模型组给予相同体积的生理盐水。末次给药1 h后，腹腔注射0.6%冰醋酸溶液，0.2 mL·只-1，观察记录各组小鼠15 min内扭体次数，计算镇痛率。镇痛率(P1)用来比较各组动物扭体次数差异(Li SH 1999)，公式为：

P1=(n-n1)n0×100%

式中：n表示模型组扭体次数；n1表示给药组扭体次数；n0表示对照组扭体次数。

1.2.4 抑菌试验供试品的制备

子实体提取物的制备：将干燥后的大马勃子实体，粉碎，分别称取15 g，共4份装于250 mL的三角烧瓶中，用100 mL的水、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、浸渍24 h，在水温40℃、频率60 Hz的超声波清洗器中超声60 min后抽滤，重复浸提3次，合并相同溶剂浸提的滤液，减压回收溶剂至剩余量约5 mL时移入已称重的小安瓿瓶中，于60℃水浴锅上蒸干溶剂，再移入60℃鼓风干燥箱中烘干，制成干粉，称重。菌丝体提取物的制备：将大马勃干燥菌丝体，研成细粉，称取15 g置于无菌安瓿瓶中，加入50 mL无菌水，于水温40℃、频率60 Hz的超声波清洗器超声60 min后静置，过滤，重复提取3次，合并滤液，浓缩，干燥，称重。发酵液提取物的制备：大马勃发酵液干粉溶于水，可直接称重溶解。

1.2.5 供试菌液的制备

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、琼脂2%。将保存的菌种活化，接入已灭菌后的新鲜培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24 h或者48 h，备用。挑选生长在琼脂上的纯菌落，直接用0.9%生理盐水稀释至9×108个·mL-1(参照麦氏比浊管)。再1∶10稀释成9×109个·mL-1。制备好的供试菌液备用。

1.2.6 抑菌滤纸片的制备

使用内直径为6 mm的打孔器在定性滤纸上均匀打孔，并且将滤纸片装入50 mL的三角烧瓶中，塞上棉塞，121℃高压蒸汽灭菌20 min后，60℃烘干。取大马勃各提取物30 mg，分别用相应的溶剂1 mL，制成30 mg·mL-1的样品溶液，另配制质量浓度为5 mg·mL-1的头孢水溶液为阳性对照，以无菌水、乙醇、乙酸乙酯、乙醚，各1 mL为阴性对照溶液。在无菌环境下，将无菌滤纸片放入以上溶液当中，浸泡3 h后，取出放入无菌平皿烘干备用。

1.2.7 抑菌圈的测定

在生物洁净工作台中，取直径为90 mm无菌平皿，加入牛肉膏蛋白胨培养基30 mL，水平放置使其凝固，用灭菌后的涂布棒分别蘸取供试菌液(金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、绿脓假单胞菌)均匀涂布于平板培养基表面，待平板水分干燥后，使用三点接种法分别将抑菌滤纸片、阳性和阴性对照的滤纸片用无菌镊子夹取到测试菌平板上，然后倒置在培养箱中37℃恒温培养24 h，每个试验设置3次重复，24 h后用游标卡尺测量各滤纸片的抑菌圈直径，根据有无抑菌圈及抑菌环直径大小判定药物抑菌效果[3]。

1.2.8 最低抑菌浓度(MIC)的测定

采用试管二倍稀释法，将大马勃各提取物准确称量0.5 g，溶于5 mL对应溶剂当中，使其充分溶解，分别对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、绿脓假单胞菌进行最小抑菌浓度(MIC)的测定。方法为取12支灭菌、带塞试管，编号1～编号12，每管加2 mL灭菌牛肉膏蛋白胨液体培养基，然后于第1支试管中加入药2 mL，混匀后吸取2 mL至第2管，第2管混匀后吸取2 mL至第3管，连续倍比稀释至第10管，混匀后弃去2 mL；第11管不加药物作为对照，观察细菌生长情况；第12管加入药液2 mL，混匀弃去2 mL，不加细菌，观察受试中药是否有污染。向编号1～编号11的试管中各加入上述稀释菌液0.1 mL，混匀，放置于37℃恒温培养箱培养24 h后观察结果。以肉眼观察，通过与11管、12管对比，不发生混浊变化的最高药物稀释倍数为该药物的MIC值[4]。

2 结果与分析

2.1 大马勃子实体、菌丝体、发酵液抗炎镇痛活性研究

2.1.1 大马勃不同提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

不同提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响结果见表1。

与模型组相比，各给药组均明显抑制耳廓肿胀，差异显著(p<0.05，p<0.01)，所以在以血管通透性为主要改变的急性炎症模型实验中，依据实验剂量，大马勃各组提取物对炎症早期的组织肿胀均有显著的抑制作用，其中大马勃发酵液抗炎效果最佳(p<0.01)，子实体与菌丝体比较接近。

注：与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01；n=10。

2.1.2 大马勃不同提取物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

不同提取物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响结果见表2。

注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01；n=10。

本实验采用的化学刺激致痛法观察到，与模型组相比，地塞米松组、大马勃子实体水提物组、大马勃菌丝体水提物组和大马勃发酵液水提物组均能减少小鼠扭体次数，差异显著(p<0.05，p<0.01)，表明对醋酸引起的疼痛均有显著抑制作用，同样，大马勃发酵液对疼痛的抑制作用最佳。

2.2 大马勃子实体、菌丝体、发酵液体外抑菌活性研究

2.2.1 大马勃不同提取物体外抑菌研究

大马勃子实体的水、乙醇、乙酸乙酯、乙醚提取物分别为4.53 g、0.82 g、0.15 g、0.07 g。大马勃菌丝干粉得到的水提物为0.12 g。抑菌结果见表3。

由表3可见，大马勃子实体不同溶剂提取物中，乙醇提取物对3种供试菌均有抑菌作用，并且抑菌效果最强；其次是乙酸乙酯提取物；大马勃水提物和乙醚提取物对绿脓假单胞菌均无抑菌作用；大马勃发酵液产物和菌丝体对3种供试菌均有抑制作用，并且大马勃发酵液产物抑菌作用明显。说明大马勃子实体、菌丝体及发酵代谢产物中均含有能抑制金黄色葡萄球菌、大肠布氏杆菌、绿脓假单胞菌的活性物质，而且菌丝体和发酵代谢产物与子实体的抑菌作用相近，可见它们含有相同或相似的具有广谱抑菌作用的活性物质。

2.2.2 大马勃不同提取物最小抑菌浓度的测定

不同提取物最小抑菌浓度的测定结果见表4。

由表4可见，大马勃不同提取物对3种供试菌有不同程度的抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌效果较好，发酵液对金黄色葡萄球菌、大马勃子实体乙醇提取物的最小抑菌浓度(MIC)均为3.15。

3 讨论

通过对大马勃子实体及发酵代谢产物的提取物进行抗炎、镇痛和抑菌实验研究，结果表明，发酵代谢产物的抗炎和镇痛活性较强，说明大马勃菌株经液体发酵培养后抗炎镇痛作用有所增加。由于大马勃子实体生长周期较长，而且考虑生物的可持续发展，可用大马勃菌株液体发酵产物来代替对子实体的利用，这样不仅节省资源，缩短时间，而且进一步提高药效，为大马勃液体发酵产物的开发与应用提供了更多的科学依据。此外，通过对体外抑菌活性试验研究为抗菌药物的筛选、抗菌谱的测定、药价测定、提取过程的追踪等提供了可供参考的数据。实验提示大马勃菌株发酵代谢产物可能成为工业化生产马勃活性化合物的新来源，具有很好的临床意义。

[1]钱海兵，孙宜春，黄婕，等. 芭蕉根不同提取物的抗炎镇痛作用研究[J].时珍国医国药，2010，21(4)：780-781.

[2]白梅荣，图雅，巴根那，等. 蒙药那如-3抗炎镇痛作用的实验研究[J].中国民族医药杂志，2010，4(4)：35-37.

[3]吕平，黄强. 苦丁茶不同提取物的体外抑菌作用研究[J]. 安徽农业科学，2009，37(34)：16838-16840.

[4]蔡正军，但飞君，陈国华，等. 红毛七的体外抑菌试验[J]. 安徽农业科学，2008，36(35)：15541-15543.

Study on Anti-inflammatory and Analgesic and Bacteriostasis in Vitro ofCalvatiagigantean

ZHANG Fan1,2, WANG Da-ke1, LI Ai-xin1, WANG Shu-min1

(1.Changchun University of Chinese Medicine, Changchun Jilin 130117; 2.Border control command academay, Guangzhou Guangdong 510440)

The anti-inflammatory, analgesic and bacteriostatic activity effect of different extracts from the fruiting bodies, the mycelia and the broth ofCalvatiagiganteanwere evaluated, to provide the basis for further development ofCalvatiagigantean. Both of the extracts ofCalvatiagiganteancould reduce aurical swelling and inhibit twisting response of mice obviously, the broth ofCalvatiagiganteanwas best, and the inhibition rates were 42.9%, 43.69%, meanwhile the different extracts had different bacteriostatic activities as different degree, and theMICwas 3.15 mg·mL-1. The fruiting bodies and liquid fermentation metabolites ofCalvatiagiganteanhad certain analgesic action and anti-inflammation effect and antibacterial, then reasonable utilization of resources and industrialized production, available fermentation metabolites to replace the fruiting bodies ofCalvatiagiganteanrelated clinical effect.

Extract ofCalvatiagigantean; Analgesic action; Anti-inflammation effect; Bacteriostasis in vitro

张帆(1986-) ，女，药剂师，主要从事中药质量标准研究，E-mail:289992174@qq.com

2014-01-15

S646.9

A

1003-8310(2014)02-0050-03

*通信作者：王淑敏，女，教授，主要从事中药生物技术研究。