高三酰甘油血症合并AMI患者APOA5基因甲基化对APOA5表达水平的影响

余长风，杜 琼

(1.仁寿县人民医院，四川 仁寿620500；2.四川省人民医院，四川 成都610072)

心肌梗死(acute myocardial infarction AMI)是常见的心血管疾病，严重的威胁人类的生命安全[1]。临床发现以动脉粥样硬化为基础的不稳定斑块破裂是导致AMI的主要原因，而高三酰甘油血症又是动脉粥样硬化的重要危险因素[2]。研究发现高三酰甘油血症和动脉粥样硬化与遗传因素有关，其中DNA甲基化异常是导致动脉粥样硬化发生重要的遗传因素之一[3]。载脂蛋白A5(APOA5)是目前已知的基因过度表达可以降低三酰甘油水平的一种载脂蛋白，但是APOA5-DNA甲基化对其APOA5表达水平的影响比较鲜见。本课题观察高三酰甘油血症合并AMI患者APOA5-DNA甲基化对APOA5-mRNA和APOA5蛋白表达水平的影响，旨在为AMI的早期诊断和干预提供一定的帮助，报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2013年3月-2013年5月在我院收治的高三酰甘油血症合并急性心肌梗死男性患者20例作为观察组，选取同期在我院体检的高三酰甘油血症合并颈动脉粥样硬化男性患者20例作为对照组。观察组：年龄(46.63±4.38)岁，体质指数(BMI)：(21.03±0.74)kg/m2。对照组：年龄(45.72±4.53)岁，体质指数(BMI)：(21.45±0.81)kg/m2。纳入标准：(1)年龄30-55岁；(2)高三酰甘油血症诊断符合《诊断学》相关诊断标准；(3)AMI诊断符合《内科学》中相关诊断标准；(4)颈动脉粥样硬化诊断参照美国超声放射学会制定的诊断标准；(5)入选前2周内未曾服用调脂药物；(6)自愿加入本研究者。排除标准：(1)肥胖和其他代谢性疾病患者；(2)合并高血压、脑卒中、糖尿病及肝肾功能不全者。两组患者在年龄、BMI等基线特征方面比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究获得本院医学伦理委员会批准，所有纳入对象均签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和处理 采集所有患者空腹静脉血2 ml，抗凝，静置1 h，高速离心取血浆200 μl，置于-80℃冰箱保存，用于检测APOA5水平。剩余的血液用于DNA和RNA提取。

1.2.2 DNA和RNA提取 采用酚-氯仿抽提法提纯血液标本中的DNA；采用人外周血淋巴细胞分离液(北京博迈斯生物科技有限公司)分离淋巴细胞后再采用Trizol试剂(上海华蓝化学科技有限公司)提纯血液标本中的RNA。采用Nanodrop-ND3300 核酸蛋白分析仪(上海智岩科学仪器公司)分别测定血液标本中DNA和RNA的浓度。

1.2.3 DNA甲基化分析 选择观察组和对照组各5例患者，采用illumina人类全基因组DNA甲基化研究芯片Methylation-450K(北京怡美通德科技发展有限公司)分别检测两组标本中DNA甲基化的差异；采用生物信息学方法分析并比较两组患者APOA5-DNA甲基化的差异，记录两组DNA甲基化的差异值，以差异值>0代表高甲基化，以差异值<0代表低甲基化；差异值的绝对值越大代表差异越大。

1.2.4 APOA5-mRNA表达水平 采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测两组患者全血RNA中mRNA。按试剂盒说明书操作。

1.2.5 APOA5蛋白表达水平 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中APOA5蛋白表达水平。按照人APOA5检测ELISA试剂盒(上海博湖生物科技有限公司)说明书检测两组患者血浆中APOA5蛋白表达水平。

1.3 统计方法

采用SPSS16.0版统计学软件进行处理。计量资料均采用均数加减标准差表示，组件比较检验分析采用t检验；以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组APOA5-DNA甲基化差异

两组差异甲基化位点共有6026个(分布于2721个基因中)，其中位于CpG岛的位点有3173个，不位于CpG岛的位点有2853个；与对照组比较，观察组DNA高甲基化的位点总共有4410个，其中位于CpG岛的位点有2398个，不位于CpG岛的位点有2012个；与对照组相比，观察组DNA低甲基化的位点共有1616个，其中位于CpG岛的位点有748个，不位于CpG岛的位点有868个。共涉及信号通路178个。其中APOA5-DNA表现为高甲基化状态，差异值为52.0384。

2.2 两组的APOA5-mRNA表达水平比较

RT-PCR结果显示：观察组和对照组的APOA5-mRNA表达水平分别为[(0.036±0.015)vs(1.002±0.089)],观察组明显低于对照组，差异具有统计学意义(t=2.303，P<0.05)。

2.3 两组APOA5蛋白表达水平比较

ELISA结果显示，观察组和对照组的APOA5蛋白表达水平分别为[(153.52±17.39) μg/L vs (198.26±23.44) μg/L],观察组明显低于对照组，差异具有统计学意义(t=2.449，P<0.05)。

3 讨论

高三酰甘油血症是动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病重要的危险因素之一[4]。有研究表明，TG水平超过2.26 mmol/L者发生急性心肌梗死(AMI)的风险要比TG水平小于2.26 mmol/L者高50%左右[5]。APOA5是载脂蛋白基因家族成员之一，已发现其在调节甘油三酯方面具有重要的作用[6]。APOA5由肝脏合成分泌，主要分布与高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒中,为目前发现的第一个能够降低血浆甘油三酯水平的载脂蛋白[7]。有研究发现，高三酰甘油血症合并冠心病患者的血清APOA5水平与血清甘油三脂水平呈负相关，因此推断血清APOA5水平可能是冠心病等心血管疾病的影响因素[8]。

表观遗传学(epigenetics)是遗传-环境-疾病的关系纽带，是指不涉及DNA 序列改变的基因或者蛋白表达的变化，并可以在发育和细胞增殖过程中稳定传递的遗传学分支学科，主要包括DNA甲基化，组蛋白共价修饰，染色质重塑，基因沉默和RNA编辑等调控机制[9]。

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团，导致DNA结合蛋白和DNA主螺旋沟之间的结合能力下降，导致遗传信息沉默，最终会导致生物学功能改变[10]。

近年来，由美国Illumina公司研发的人类全基因组DNA甲基化研究芯片，成为DNA甲基化研究的广泛选择对象，其集全面、高通量和价格低廉等优点为一体，一次可以检测450k个甲基化位点，能覆盖大约96%的CpG岛[11]。研究发现人类全基因组DNA甲基化研究芯片与传统的亚硫酸氢盐修饰后测序法在DNA甲基化检测方面具有较强的一致性，但亚硫酸氢盐修饰后测序法需要大量的克隆测序，程序繁琐并且价格昂贵[12]。因此，本研究采用人类全基因组DNA甲基化研究芯片进行DNA甲基化的检测。

目前，关于高三酰甘油血症合并AMI患者的APOA5表达与其DNA甲基化之间的关系的报道尚比较少见。本研究选择30-55岁的男性高三酰甘油血症合并AMI患者进行研究，排除了性别和激素水平对DNA甲基化的影响。结果显示，与对照组中高三酰甘油血症合并颈动脉粥样硬化患者相比，观察组中高三酰甘油血症合并AMI患者表现为APOA5-DNA高甲基化。同时，进行了RT-PCR和ELISA检测，结果显示，观察组中高三酰甘油血症合并AMI患者的APOA5-mRNA表达水平和APOA5蛋白表达水平均明显低于对照组中高三酰甘油血症合并颈动脉粥样硬化患者，表明APOA5-DNA高甲基化表现为APOA5-mRNA和APOA5蛋白水平的低表达。

综上所述，高三酰甘油血症合并AMI患者APOA5-mRNA和APOA5蛋白水平降低均与APOA5-DNA甲基化水平增高有关，APOA5-DNA甲基化异常可能参与了高三酰甘油血症患者动脉粥样硬化的进展。本研究纳入样本数量较小，为获得更加真实可靠的数据，尚待扩大样本数量进一步深入研究。

参考文献：

[1]Chokshi N,Blumenschein SD,Ahmad Z,et al.Genotype-phenotype relationships in patients with type I hyperlipoproteinemia [J].J Clin Lipidol，2014，8(3):287.

[2]Cha S,Yu H,Park AY,et al.Effects of apolipoprotein A5 haplotypes on the ratio of triglyceride to high-density lipoprotein cholesterol and the risk for metabolic syndrome in Koreans[J].Lipids Health Dis,2014,13(1):45.

[3]Hubacek JA,Peasey A,Kubinova R,et al.The association between APOA5 haplotypes and plasma lipids is not modified by energy or fat intake:The Czech HAPIEE study[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2013，9(5)：243.

[4]Zaki M,Amr K.Apolipoprotein A5 T-1131C variant and risk for metabolic syndrome in obese adolescents[J].Gene，2014，534(1):44.

[5]谢羽飞，赵水平.载脂蛋白A5在调节三酰甘油代谢中的作用[J].基础医学与临床，2014，34(2)：274.

[6]杨梦迪，魏文青.载脂蛋白A5基因多态性与血脂代谢的关系[J].医学综述，2013，19(20)： 3683.

[7]Li XP,Gong HR,Huang XS,et al.The influence of statin-fibrate combination therapy on lipids profile and apolipoprotein A5 in patients with acute coronary syndrome[J].Lipids Health Dis，2013，12(1):133.

[8]戴海鹰，林楚伟，石卓勋,等.载脂蛋白A5基因多态性对代谢综合征及其心血管事件发生的影响[J].中国医师杂志，2013，15(3)：321.

[9]魏红霞，宋宏岩，李 雷,等.载脂蛋白A5启动子片段荧光表达载体的构建及瞬时表达[J].中华实验外科杂志，2013，30(2)：409.

[10]Zhou J,Xu L,Huang RS,et al.Apolipoprotein A5 gene variants and the risk of coronary heart disease:a case control study and meta analysis[J].Mol Med Rep，2013 ，8(4):1175.

[11]林 静，王 劲，张 强,等.载脂蛋白A5对血脂代谢及其相关疾病影响的探讨[J].国际检验医学杂志，2012，33(17)：2153.

[12]Novotny D,Vaverkova H,Karasek D,et al.Genetic variants of apolipoprotein A5 T-1131C and apolipoprotein E common polymorphisms and their relationship to features of metabolic syndrome in adult dyslipidemic patients[J].Clin Biochem，2014， 42(3):2.