肾阳虚动物模型的现代研究进展

张 琰 邓树泳 马 娜 邢德刚

(广东药学院生理学教研室，广东 广州 510006)

肾阳虚是肾阳虚弱，温煦无力，气化失常，阴寒内生，并使性与生殖能力减退的病理变化。肾阳虚即意味着人体生命活动机能的衰退与减弱，临床以腰膝酸软、畏寒肢冷、阳痿早泄等为主要表现的证侯。常见于哮喘、泄泻、虚劳、水肿、癃闭、阳痿、带下，以及西医的慢性肾炎、慢性肾衰竭、慢性肠炎、肾上腺皮质机能减退、慢性心衰等疾病。建立有效的动物模型是肾阳虚证研究工作中不可缺少的一个重要环节。

1 激素造模法

1.1糖皮质激素 肾阳虚造模方式主要分病理造模和病因造模,且以病理造模多见。糖皮质激素造模是病理造模应用最广泛的造模方法。大量的实验研究观察了皮质激素肾阳虚模型几乎全身所有系统的变化。包括模型机体代谢水平下降,免疫功能下降,广泛的器官病理损害,中枢神经系统和自然神经系统功能的改变,体内各种激素含量、脂质过氧化物的增加和自由基清除系统功能的低下,血细胞系统各种成分, 血液内各种离子浓度,血循环流变学等方面都有不同程度的变化。糖皮质激素造模其用药及成模时间一直在变化。从开始的短效到长效激素,从连续用药到间歇用药并且停药,从1～2 w到30 d,从皮质醇制剂到皮质酮制剂。

糖皮质激素造模氢化可的松应用的最多,约占全部肾阳虚模型的30%，可能是这样的模型直观、稳定、简便易行。该模型主要通过影响下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能，导致动物对外界环境变化的应激、适应能力下降，而出现阳虚表现。动物的生命活动减弱、畏寒喜暖的表现也与肾阳虚的表现一致〔1〕。最早建立的肾阳虚模型是邝安堃等〔2〕的氢化可的松动物模型,实验用16～20 g雄性小白鼠，每日臀部肌肉注射醋酸皮质素,大剂量0.5 mg/d，中剂量0.25 mg/d，结果两组在不同时间均出现了一系列肾阳虚表现，在合用助阳药时，动物多不出现衰竭现象，或仅是轻度的虚弱，体重的减轻不甚明显，与未合用助阳药的动物显然有别。此法后得到推崇与效仿。

沈自尹等〔3〕采用皮质酮所致的大鼠肾阳虚模型，测定不同配伍方式的淫羊藿总黄酮、知母总皂苷和甘草次酸及其组合物对肾脏和免疫功能的保护作用，结果表明，有滋阴、温补肾阳作用的中药组合物能够有效保护外源性皮质激素作用下的肾脏和免疫功能，具有开发为新药的潜力和应用价值。

1.2雌二醇 以雄鼠肌注雌二醇的方法造成另一种肾虚模型,用以模拟临床上老年男性雌雄激素改变的趋势。苯甲酸雌二醇法能诱发大鼠小鼠下丘脑-垂体-性腺轴受抑制而造成肾阳虚模型,动物出现活动能力减弱、抗疲劳功能下降等表现。吕圭源等〔4〕在观察比较甘凉归肝肾经(女贞子、龟甲)与甘温归肝肾经(海马、菟丝子)中药对雌二醇致小鼠肾阳虚的影响时，将ICR雄性小鼠，随机分为正常对照组、模型对照组、金匮肾气丸组、女贞子组、龟甲组、海马组、菟丝子组。除正常对照组外，其余各组按10 ml/kg腹腔注射0.4 mg/ml的苯甲酸雌二醇大豆油稀释液，1次/d，连续12 d，造成肾阳虚模型。各给药组按相应剂量灌胃给药，正常对照组和模型对照组灌胃等容积水，1次/d，连续12 d。

2 其他药物造模法

2.1羟基脲法 羟基脲是一种核苷二磷酸还原酶抑制剂，可以阻止核苷酸还原为脱氧核苷酸，因而选择性地抑制DNA的合成，并能直接损伤DNA，影响蛋白质代谢，出现一系列肾虚症状。

楚生辉等〔5〕观察七肾汤对羟基脲肾虚大鼠生育力的影响时，将雄、雌性大鼠随机各取10只动物作为正常组，其余大鼠给予羟基脲片500 mg·kg-1·d-1灌胃，连续30 d，造成雌、雄性生殖功能障碍大鼠模型，观察七肾汤对雌性模型大鼠动情周期变化，卵巢、子宫重量；雄性模型大鼠睾丸、附睾重量，精子密度与活率。

2.2腺嘌呤法 腺嘌呤是核酸的主要组成成分之一，当机体摄入大剂量腺嘌呤时，异常高浓度的腺嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下则转变成极难溶解于水的2,8-二羟基腺嘌呤，这种代谢产物沉积于肾小管，引起肾衰竭，腺嘌呤代谢产物不仅仅因机械性阻塞肾小管而引起肾衰竭，而且还可能由于腺嘌呤代谢产物毒性作用，使肾组织中与糖、脂肪、蛋白质代谢有关的多种酶活性受抑制，影响了肾组织的能量代谢。邵命海等〔6〕用腺嘌呤诱导SD大鼠肾阳虚模型并从肾主生殖的角度与氢化可的松诱导的肾阳虚模型进行比较。其方法为对氢化可的松低、中、高剂量组分别予肌肉注射氢化可的松0.5 mg/100 g,2 mg/100 g,5 mg/100 g，共2 w；腺嘌呤组予2%腺嘌呤混悬液2 ml灌胃4 w。结果发现腺嘌呤制作的SD大鼠肾阳虚证动物模型睾丸萎缩，精曲小管退化变性，精囊萎缩，前列腺体明显萎缩甚至消失，肾上腺皮质变薄，以束状带萎缩明显，睾酮水平偏低，这些变化较氢化可的松诱导组明显。

2.3氨基导眠能法 氨基导眠能使类固醇激素合成受阻,造成垂体-肾上腺皮质和垂体-性腺轴功能减退的阳虚模型。用灌胃或口服氨基导眠能方法造成的模型具有肾上腺重量减轻,肾上腺皮质萎缩,血浆皮质醇减少,肾上腺组织cAMP水平降低等变化。蔡连香等〔7〕在实验中采用雌性新西兰白兔,3～4月龄,1.6～2.4 kg,每天胃管投氨基导眠能6 mg/kg(用蒸馏水配成10 mg/ml混悬液),连续15 d。动物表现为体重减轻,体温下降,出现拱背穹起,毛发卷曲,稀疏而无光泽,摄食减少,对外界刺激反应迟钝, 萎靡不振等。氨导所致模型家兔的表现兼备了阳虚和肾虚证共有的症状,可用来探讨补肾药的作用机制。

2.4甲状腺抑制药物法 常用来造模的甲状腺抑制药物有丙基硫氧嘧啶，他巴唑和甲基硫氧嘧啶。

丙基硫氧嘧啶模型动物T3、T4含量下降。模型中枢内去甲肾上腺素含量无显著变化。大脑皮层、海马肾上腺素能β受体减少,肾上腺素能α1受体和小脑肾上腺素能β受体无显著变化,反映出模型脑内交感神经系统活动减弱。卢德赵等〔8〕研究发现肾阳虚大鼠出现少饮少食、体质量减轻、反应迟钝、活动减少、拱背耸毛、毛色无光泽、易脱落，叫声低弱等症状，而正常组大鼠表现如常。

他巴唑模型在已有的检测项目中与丙基硫氧嘧啶动物大体一致,另外模型血清中环磷酸腺苷(CGMP)含量的升高,血超氧化物歧化酶(SOD)减少,脑内丙二醛含量增加,显示造模有一定细胞毒性作用。模型还有胸腺、睾丸重量下降,模型肝、肌肉、垂体、心等存在不同程度的组化和病理改变。欧阳轶等〔9〕用他巴唑建立SD大鼠肾阳虚模型，观察模型的体温、体重变化及血清皮质醇(CORT)、T3、T4、睾酮(T)/雌二醇(E2)等指标，模型下丘脑-垂体-肾上腺轴、甲状腺轴、性腺轴个轴的变化。认为大鼠他巴唑模型可以出现明显的体温下降。血清T3、T4下降，而对肾上腺轴和性腺轴的干扰不明显,只适用于甲状腺功能低下的肾阳虚证。

甲基硫氧嘧啶模型有睾丸、胃、十二指肠的病理改变,血浆皮质醇含量减少。但与丙基硫氧嘧啶和他巴唑相比,甲基硫氧嘧啶的副作用最强。因此到底所观察到的现象是肾阳虚的表现抑或是药物副作用,还有待鉴别。

3 手术造模法

手术造模是通过切除动物肾上腺、甲状腺、性腺等造成体内激素水平下降，建立肾阳虚模型。

肾上腺切除造模是通过肾上腺次全切除和双侧肾上腺全切造成肾上腺皮质功能低下。以肾上腺切除法造成的模型使卵巢重量下降,雌激素受体解离常数上升；舌组织表现为营养及代谢降低的病理变化与甲基硫氧嘧啶阳虚动物的表现一致。史念珂等〔10〕使用SD大鼠进行肾上腺次全切除手术，建立肾上腺功能低下动物模型。手术后大鼠出现了肾上腺功能低下状态。然而这种方法对模型动物伤害太大,使该方法难以开展。另外,阳虚证需要有肾上腺皮质功能抑制表现,但机体中仍然存在着下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的反馈, 切除肾上腺的方法切断了这一反馈的途径,与临床实际相距太远。

甲状腺切除法即切除动物甲状腺组织造成甲减模型，出现畏寒、肢冷、迟脉等肾阳虚主证。伏蕊等〔11〕研究说明甲状腺摘除术确实可以造成大鼠甲减。而甲状腺完全摘除者，可造成大鼠明显甲减，更有利于排除甲状腺激素对实验目的的影响。但该方法大鼠死亡率较高，且完全摘除甲状腺的成功率较低。

切除动物性腺即去势法包括切除雄性动物双侧睾丸或雄性动物双侧卵巢。睾丸模型有提肛肌、包皮腺、前列腺、精液腺重量下降、阴茎勃起时间延长、持续时间缩短等生殖系统的衰退表现外,还有耐力下降、耗氧减少、体温下降等。该模型血浆促黄体素、促卵泡激素含量上升,雌二醇与睾酮含量下降,T/E下降。

卵巢切除模型下丘脑、垂体、血中的β内啡肽含量和下丘脑亮氨酸脑啡肽含量均下降,子宫重量下降,红细胞Ca-Mg-ATP酶、Mg-ATP酶、蛋白激酶C等含量下降,骨组织内钙、锰、铜、锌、镁等含量下降。

大多数文献并不将(雌雄)去势动物当作阳虚模型。事实上,尽管睾丸全切动物体内雌雄激素的含量表现出与其他某些阳虚模型相类似的变化趋向, 然而单纯以去除内生殖器官的方法所模拟的肾阳虚显然是片面的。

4 传统病因造模法

阳虚是指机体阳气虚损，机能减退或衰弱，代谢缓慢，产热不足的病理状态。形成阳虚的主要原因多由于先天禀赋不足，或后天失养、劳倦内伤、久病损伤阳气所致。肾主生长发育和生殖，房事不节必耗肾精，日久则伤阴损阳，导致肾阳虚。运用传统病因病机学说中的致病因素(通常为改变动物的生理、心理状况、生活环境及给予过量中药等)作为诱发因素,使实验动物在该因素作用下产生中医理论上成立的相关病证所造成的模型更符合中医疾病的因果关系理论和中医研究目标, 这种模型被称为病因模型。主要有以下四种。

4.1房事伤身动物模型 雄性动物在短时间内与同一动情期雌性动物连续交配数次，当出现呆滞疲劳状态时，再放入另一只新的动情期雌性动物，又可立即兴奋起来，而进行交配，称Coolidge效应。同时采用游泳以造成劳倦过度。如此多次造成肾阳虚模型。张丹等〔12〕利用Coolidge效应建立肾阳虚模型，利用传统治疗肾阳虚证的代表药物——金匮肾气丸治疗后，肾阳虚症状均明显好转，为本模型的建立提供了中药的反证依据。

4.2老年肾阳虚动物模型 临床研究结果显示，老年人与肾阳虚病人在内分泌轴(主要是甲状腺与性腺轴)及免疫功能上具有相似的反馈调节能力异常,只是肾阳虚病人功能紊乱的程度较老年人更为明显。老年人虽不一定具有肾(阳)虚外象，却具有肾(阳)虚证的内涵, 因此，可称之为生理性肾虚。据此，人们亦选择老龄动物作为肾(阳)虚证模型来使用，但临床关于衰老本质的研究结果并未能完全支持这种模型的肾阳虚辨证: 衰老并非疾病, 参与老化的因素很多，个体差异也很大, 仅凭年龄或外表来判定衰老程度还不够全面。因此，用老龄动物作肾阳虚证模型还需要进一步完善。

4.3恐伤肾致肾(阳)虚动物模型 “在脏为肾……在志为恐”，“恐伤肾”，“恐则气乱”，根据这一中医理论利用造成肾虚证模型。主要有猫吓鼠、人吓猫及爆竹吓狗等方法，造成的病理损害以生殖腺损伤最为显著。类似的还有皮肤烧伤法、悬吊应激法等。孙理军等〔13〕将成年(10 w)雄性SD大鼠放入特制的小铁丝笼内，再将此小笼固定在装有2只家猫的大笼中，让家猫与大鼠仅一网之隔，使猫爪能碰到但无法抓到大鼠，并且每天上午10∶00、下午3∶00各另取两只活的实验淘汰大鼠喂猫，以其凄惨场景示众，造成模型大鼠的恐吓，使其惊恐伤肾。随着时间的延长，所造肾虚质模型雄鼠出现萎靡不振，体重下降，拱背倦怠，踡缩扎堆，活动减少，眼中无神，大便偏湿或便溏，小便色赤量多或清长等特征。

4.4先天肾虚动物模型 根据初生儿体弱瘦小属胎禀怯弱、肾精不足之胎怯的中医理论,筛选初生3 d内、体重显著不足的动物，或利用中医恐伤肾理论用恐吓孕鼠造成子鼠先天肾虚。胎怯者机体宫内发育未成熟,先天禀赋不足,表现为生长发育迟缓,生理功能低下,其证候为脾肾两虚尤以肾虚为突出。实验研究发现胎怯模型存在垂体-甲状腺、肾上腺等内分泌失调,而恐吓孕鼠造成的子鼠先天肾虚存在行为学方面的异常,用金匮肾气丸温补肾阳药能预防和改变之。但尚未对其肾阳虚辨证进行研究论证〔14,15〕。

5 其他方法

肾阳虚的造模方法还有很多,例如人工高血糖法〔16〕,锁阳水灌注法〔17〕，庆大霉素法〔18〕,环磷酰胺法〔19〕等等, 这些方法的使用率不高,重复报道者少,也不被肯定,故不加详述。

6 结 论

肾阳虚造模方式主要分病理造模和病因造模，且以病理造模多见。这是因为大量来自临床的关于肾阳虚证本质的病理研究成果作为直接依据使肾阳虚证病理在动物体上的再现比单纯传统病因造模更直观、更理性。但各种病理模型的造模方法在给药途径、用药剂量、造模时间上差异较大，缺乏规范化、标准化给药理药效学研究带来不便，其结果的可靠性也因此受到质疑。例如,用糖皮质激素造模,剂量大动物过于衰弱甚至死亡,剂量小动物不出现症状；又如肌注给药,动物因肌注而致腿瘸,在很大程度上影响动物的状态,以致影响实验结果；而腺嘌呤法,由于药物混在饲料里，很难确保药物的剂量,而致造模程度不一致，用此模型来观察药物疗效，不一定能确切反映其结果。

目前，主张传统病因造模者越来越多，其符合中医理论,也适用于中医药基础和临床的研究,尽管其方法不多,但有很好的发展前景。但是同一中医的病因可以导致不同的病证，同一病证又可以有不同的病因，所以利用单纯中医病因作依据造成动物的病理改变并不能说明它属于某一个证，我们仍要对其进行辨证,但辨证的依据还是一个悬而未决的问题。

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