自噬相关基因Beclin 1沉默对人肺癌A549细胞顺铂耐药性的影响

任 爽 秦艳茹 张 岩 贾永旭 赵 松

(郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052)

顺铂(DDP)是肺癌化疗常用的药物之一，通过干扰DNA复制诱导细胞凋亡，还能促进细胞自噬性死亡，但癌细胞容易对其产生耐药性。因此，如何增加癌细胞对其敏感性是困扰临床亟需解决的问题。相关研究认为自噬是化疗药物作用机制之一，可能在耐药性中发挥一定作用〔1〕。本实验通过沉默自噬相关基因Beclin 1，探讨其对人肺癌A549细胞DDP耐药性的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人肺癌A549细胞株由河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室冻存。Psilencer3.1质粒为郑州大学基础医学院病理生理教研室保存。RPMI 1640培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司。梭华-Sofast基因转染试剂购于Calbiochem公司。T4 DNA连接酶、质粒提取试剂盒，购于南京凯基生物科技发展有限公司。Beclin 1、β-actin单克隆抗体购于Santa Cruz。四甲基偶氮唑盐(MTT)购于Sigma公司。DDP购于山东齐鲁制药有限公司。

1.2Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1重组质粒的构建与鉴定 根据GenBank(NM_003766)Beclin 1基因mRNA的已知序列，选择2个靶位点(285-304、676-695)，每条模板链的组成包括19个碱基正义链和与其互补的19个碱基的反义链，正反链之间有9个碱基(TTCAAGAGA)间隔，反义链之后有5个T作为转录终止信号，在模板链的两端加入Bam HI及Hind Ⅲ酶切位点。两条链在退火缓冲液〔100 mmol/L K-acetate，30 mmol/L Hepes-KOH，(pH7.4)，2 mmol/L Mg-acetate〕作用下退火(90℃ 3 min，37℃ 1 h)，形成双链结构，在T4 DNA连接酶作用下连接于线性化的Psilencer 3.1质粒上，Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1重组质粒通过测序，RT-PCR及Western印迹方法鉴定。

1.3细胞培养 A549细胞常规培养于37℃、5%CO2、含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中。A549/DDP细胞的培养条件同前，但每隔两代培养液中加入终浓度5 μmol/L的DDP以维持耐药性。

1.4细胞筛选、转染与分组 转染前24 h，将生长状态良好的A549/DDP细胞按1.5×105个/孔接种于24孔板，37℃、5%CO2恒温培养。次日待细胞70%～80%融合时，将重组质粒转染A549/DDP细胞(C组)，以空载体转染细胞(B组)和未转染的A549/DDP细胞(A组)为对照。

1.5RT-PCR方法检测Beclin 1 mRNA的表达 收集A、B、C组细胞，总RNA提取按Invitrogen公司Trizol试剂盒说明书操作，以DNA/RNA测定仪测定RNA的纯度和浓度。按逆转录合成试剂盒说明合成cDNA待用。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照，目的片段为452 bp，引物序列为:上游：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。Beclin 1序列为：上游：5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3′，下游：5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3′，目的片段为363 bp。PCR条件：94℃ 1 min。55℃ 1.5 min。72℃ 0.5 min，共30个循环。结果用Quality One分析，以阳性条带与GAPDH光密度比值作为阳性条带的相对表达值。

1.6Western印迹检测Beclin 1 蛋白的表达 收集各组细胞，用RIPA buffer 200 μl裂解细胞，考马斯亮蓝法进行蛋白定量，常规电泳、转印和封闭后，分别加Beclinl抗体(1∶1 000) 4℃孵育过夜，碱性磷酸酶标记二抗(1∶3 000)，室温孵育2 h，碱性磷酸酶染色5 min，胶片曝光显影，结果用Quality One分析。用β-actin为内对照，以阳性条带与内对照光密度比值作为阳性条带的相对表达值。

1.7MTT法检测细胞对DDP的耐药性 将各组细胞按2×103个/孔接种于96孔板，24 h后加入终浓度为0、10、20、30、40、50、60、80、100、120 μmol/L的DDP，每浓度设3个复孔。孵育3 h后更换成完全培养基。72 h恢复期后每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，作用4 h后弃去上清液，酶标仪测量570 nm波长处的吸光度(A)值。计算细胞存活率，方法为各浓度组A值/未加药组A值×100%，以Bliss法计算半数抑制浓度(IC50)。

1.8MTT法检测细胞增殖情况 取对数生长期的各组细胞，胰酶消化后按2×103个/孔接种于96孔板，每组设6个复孔，共接种5板。每间隔1 d取出1板，MTT法测定A值。

1.9流式细胞仪检测细胞凋亡情况 胰酶消化各组细胞，调整密度为1×106个/ml，冰磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，结合缓冲液重悬细胞，分别加入annexin V-APC 5 μl和PI溶液10 μl，室温避光孵育15 min，LSRII流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)检测细胞凋亡情况，Cell Quest软件进行分析。

2 结 果

2.1转染后A549/DDP细胞中Beclin 1基因的表达情况 以A组Beclin 1基因的表达水平为100%，C组细胞中Beclin 1 mRNA的表达水平下降(80±5)%，Beclin 1蛋白的表达水平下降(74±5)%，差异均有统计学意义(均P<0.05)；B组细胞中Beclin 1 mRNA和蛋白的表达水平是A组的(102±4)%和(96±7)%，差异均无统计学意义(均P>0.05)。

2.2转染后A549/DDP细胞对DDP的耐药性及增殖情况 与A、B组细胞相比，C组与DDP孵育后的细胞存活率明显降低；C组细胞对DDP的IC50为(18±3)μmol/L，与A组细胞〔(40±12)μmol/L〕、B组细胞〔(42±9)μmol/L〕比较，差异有统计学意义(P<0.05)；B组细胞与A组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3检测后三组细胞凋亡率情况 流式细胞仪检测C组细胞凋亡率为(9.5±1.1)%，与B组细胞〔(4.0±1.5)%〕、A组细胞〔(3.9±1.3)%〕比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

3 讨 论

Beclin 1是参与自噬的特异性基因，位于人类染色体17q21上，大约有150 ku。Beclin 1通过调节自噬水平参与细胞内大分子物质的循环及再利用、受损细胞器的清除，并维护细胞内环境稳态。DDP是用于肺癌的一线化疗药物，可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤细胞膜结构，但其肿瘤耐药性一直是临床治疗难以克服的障碍〔2〕。有研究〔3〕表明DDP等药物可引起肿瘤细胞发生自噬，说明自噬可能与肿瘤耐药性存在一定的关系。本研究结果提示Beclin 1基因沉默能一定程度地恢复A549/DDP细胞对DDP的敏感性，表明Beclin 1基因在肺癌DDP耐药过程中发挥着重要作用。同时发现，细胞凋亡可能是Beclin 1基因参加肺癌DDP耐药的机制之一。

本研究发现，靶向Beclin 1基因的质粒稳定转染A549/DDP细胞后，细胞的增殖能力下降，可能与Beclin 1基因参与细胞周期的调控有关。提示Beclin 1基因在肿瘤细胞增殖中发挥着重要作用，通过RNA干扰下调Beclin 1基因表达，能抑制肿瘤细胞恶性增殖信号传导，阻滞细胞周期进展，使细胞增殖能力下降。

综上，以Beclin 1基因为靶点的RNA干扰技术可有效恢复A549/DDP细胞的化疗敏感性，抑制细胞的增殖能力，针对Beclin 1的基因治疗可能逆转肺癌DDP耐药。

4 参考文献

1Rosenfeldt MT, Ryan KM.The role of autophagy in tumour development and cancer therapy〔J〕. Expert Rev Mol Med,2009;11:e36.

2潘丽红, 赵 松, 党丽峰, 等. 自噬在蛋白酶体抑制剂诱导的食管鳞癌细胞死亡中的作用〔J〕.中华实验外科杂志, 2013;30(11): 2339-41.

3刘东雷, 王建军, 杨 洋, 等.自噬在顺铂诱导的食管癌细胞死亡中的作用〔J〕.中华实验外科杂志, 2010;27(9):1198-9.