猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero细胞中繁殖条件的优化

王 琳 邢育钢 李继昌 东北农业大学动物医学学院 150030

本实验对猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero 细胞中的增殖规律进行了进一步探索，以获得该疫苗株增殖的最佳条件，从而为猪流行性腹泻病毒细胞疫苗的研究奠定基础。

1 材料与方法

（1）毒株。猪流行性腹泻病毒疫苗株（CV777）由本单位提供。病毒粒子浓度为5×108PFU/mL。

（2）主要试剂。DMEM 培养基购自Gibco 公司，进口胎牛血清购自Hyc1one，胰酶购自Washington公司。

（3）细胞及传代培养。Vero 细胞来自哈尔滨兽医研究所，在本实验室已扩增冻存，目前在本实验室传至130 代，已经适应在本实验室的培养基中生长。满瓶的Vero 细胞用0.25%胰酶-EDTA 消化脱壁后，用10%DMEM 培养基（含10%进口胎牛血清）终止消化并稀释到2～3×105个/mL，在10L 转瓶（内壁表面积约为4000cm2)中加入培养基1000mL，细胞重新贴壁以后密度约为5～6×104个/cm2，在37℃恒温中，转瓶机釆用12 转/h 培养72h，细胞长成单层以后密度约为4×105个/cm2，用于接毒或传代。

（4）PEDV 在六孔板培养体系中的繁殖试验。取长满Vero 细胞的六孔板（每孔直径为3.5cm，表面积为9.5cm2)两块（做两组平行对照，分别标记为NC1 组、NC2 组），每孔细胞密度约为4×105个/cm2，弃去培养基，用PBS 缓冲液洗涤三次，以去除残留培养基。每孔加入200μL 病毒液，5%CO2培养箱中37°C 吸附1h，弃去病毒液，补加维持液（不含血清的DMEM 培养基）2mL，胰酶浓度为5μg/mL，每板留一孔不接毒只更换维持液作为空白对照，接毒后置于5%CO2培养箱中37°C 进行培养，每隔12h 观察细胞病变情况，同时收取每孔的细胞培养上清，3000 rpm 离心5min 后放入-20°C 保存，至接毒后72h。最后收取空白对照孔细胞培养上清，上清样冻融后，按照Reed-Muench 法计算TCID／0.1mL。

TPCK 胰酶浓度对病毒在Vero 细胞中增殖的影响。按照1.4 步骤中摸索的初步条件，分别在接毒后加入TPCK-胰酶终浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、7.5μg /mL、10μg /mL 和不加胰酶6 组接毒试验，每组做2 组平行。比较各组结果，以确定TPCK-胰酶对病毒在Vero 细胞中增殖的最佳浓度。

接毒量对病毒在Vero 细胞中增殖的影响。在最佳TPCK 胰酶浓度条件下，分为4 个不同接毒剂量组，分别病毒粒子浓度为5×108PFU/mL 的病毒，MOI 分别为1、0.1、0.01、0.001 每个接毒剂量设置2个平行对照组，设1 组只更换维持液无病毒的空白对照，比较各组结果，以确定最佳接毒剂量。

（5）PEDV 在10L 转瓶中增殖试验。根据在6孔板中探索的最优条件，接毒后10L 转瓶的维持液体积为1000mL。共接毒3 个10L 转瓶，接毒后每隔12h 收取细胞培养上清，3000rpm 离心5min 后放入-25℃保存，直至接毒后72h，上清样品冻融后，按照按Reed-Muench 法计算TCID／0.1mL。

2 结果

2.1 六孔板病毒增殖试验结果

（1）细胞病变情况。接毒后每隔12h 观察细胞病变，发现接毒后18h 少数细胞病变，24h 后细胞出现明显病变，细胞肿胀变圆，折光性增加，颗粒物质增多，培养后期出现细胞脱落。

图1 接毒前后Vero 细胞的形态观察

（2）六孔板中病毒增殖试验结果。接毒后采取的细胞培养上清进行毒价检测，结果见表1。在接毒后60h 病毒增殖滴度达到峰值1×106.3TCID50/0.1mL，空白对照无病变。峰值可维持12h、72h 以后病毒效价略有下降。

表1 六孔板屮接毒Vero 细胞后不同时间点病毒滴度（TCID50/ 0.1mL)

（3）接毒量对病毒在Vero 细胞中增殖的影响结果。对保存的10L 转瓶中Vero 细胞接毒样品进行TCID50 检测，空白对照组无病变，其余各组检测结果见图2。接毒量MOI 为0.1、1 时病毒均能获得较好的增殖，病毒效价峰值均可以达到1×106.5TCID50/0.1mL，而当接毒量小于0.1 时，病毒的感染量较低，效价上升速度慢，最终未能达到峰值。

图2 不同接毒量对病毒在Vero 细胞中增殖结果

（4）胰酶浓度对病毒在Vero 细胞中増殖影响的结果。对加入不同浓度胰酶条件下病毒增殖检测结果见图3。当胰酶浓度低于5μg/mL，病毒增殖速度明显减慢，毒价未能达到峰值，当胰酶浓度为7.5μg/mL 时，病毒增殖较稳定，毒价能达到峰值。当胰酶浓度达到10μg/mL 时，细胞很快在3～4h 内被胰酶消化脱落，因此病毒无法增殖，表明该疫苗株在Vero 细胞中增值的最佳胰酶浓度为7.5μg/mL。

图3 不同浓度胰酶条件下病毒增殖的TCID50 检测结果

2.2 PEDV 在10L 转瓶中增殖试验结果

对3 个10L 转瓶中Vero 细胞的接毒试验样品进行病毒效价检测，结果见图4。接毒后12h 即可检测到病毒效价，随时间延长逐渐上升，在60h 能达到最高，且峰值可以维持到72h,之后开始下降。

图4 PEDV 在10L 转瓶中增殖试验结果

3 讨论

本试验对PEDV 疫苗株在6 孔板和10 L 转瓶大规模增殖的条件进行了研究，在比较试验结果后确定胰酶终浓度为7.5μg／mL 作为该疫苗株大规模增殖的最佳浓度；最佳接毒剂量选择MOI=1，在此条件下病毒增殖最高毒价均可以达到106.0/0.1mL 以上，充分说明该疫苗株具有高度适应在Vero 细胞大规模增殖的特性，为该疫苗株应用于大规模生产提供了依据。

本试验在确定最佳胰酶终浓度时发现，该疫苗株在Vero 细胞大规模增殖过程中，胰酶的加入是必不可少的。同时在对加入不同胰酶浓度进行比较中发现，在浓度为5～7.5μg／mL 范围内病毒增殖速度随胰酶浓度的增加上升。这是因为PEDV毒株不同而引起对胰酶的敏感性有所差异。另外不同代次Vero 细胞对病毒增殖的敏感性不同也是引起病毒增殖对胰酶依赖性不同的重要因素。

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[2]张世忠,江 斌.2011年福建省猪流行性腹泻的流行特点及其防治措施.福建畜牧兽医，2012，34:23-25.

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