高效液相色谱法检测蚕蛹油中主要脂肪酸的研究

崔志芳，彭奇均

（江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡214122）

蚕蛹是缫丝业的大宗副产物，蚕蛹油是从蚕蛹中提取的淡黄色至褐色油状物[1]。亚麻酸、棕榈酸、油酸是蚕蛹油中的主要脂肪酸。亚麻酸是人体必需的脂肪酸，在机体具有重要的生理功能，如调节血脂、改善心脑血管疾病、保护视力等[2]；棕榈酸和油酸在化工和医药领域也有重要的应用[3]。

脂肪酸的检测一般采用气相色谱法，但分析过程中柱温较高（＞180℃），易使不饱和脂肪酸的双键断裂或双键异构化，且该方法分析前需要对脂肪酸进行甲酯化，甲酯化过程中脂肪酸可能生成不完全甲酯衍生物，也可能发生异构化或者水解等反应，导致测试结果准确度不高[4-5]。高效液相色谱-荧光检测法具有较高的灵敏度，但该方法也存在衍生试剂不稳定、重现性差、进样前处理操作繁琐等缺点[6]。蒸发光散射检测器（ELSD）作为一种新型通用型检测器，已经越来越多的应用于化工、食品等领域[7]。HPLCELSD法分析检测脂肪酸类化合物具有样品无需前处理，分离效果好、灵敏度高和选择性好等特点[8]。刘涛[9]建立了一种利用反相高效液相色谱-蒸发光散射检测、通过梯度洗脱测定油脂中脂肪酸和甘油酯含量的方法，并考察了醋酸含量对色谱分离效果的影响。Mengesha A E[10]采用HPLC-ELSD法分析检测卵磷脂水解产物中的游离脂肪酸，对亚油酸的线性范围、相关系数、检出限和回收率等进行了考察。但HPLC-ELSD应用于蚕蛹油脂肪酸的分析研究鲜有报道。

本研究采用HPLC-ELSD法分析蚕蛹油中的亚麻酸、棕榈酸和油酸，考察色谱条件对三种脂肪酸分离效果的影响规律，以期建立简便、可靠、适用性好的脂肪酸定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

棕榈酸、油酸、亚麻酸、乙酸 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈、丙酮 色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水 由Heal Force纯水系统（利康发展有限公司）制备；蚕蛹油 四川自然而然生物分离有限公司。

Waters1525型高压液相色谱仪、Waters2420型蒸发光散射检测器 美国沃特世科技有限公司；HB230A型柱温箱 汉邦科技有限公司；AL104电子分析天平 梅特勒-托利多中国地区；SK3300H型超声波清洗仪 美国KUDOS。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液制备 称取亚麻酸、棕榈酸、油酸标准品各0.1g，分别溶于25m L丙酮中，配制4.0mg/m L的脂肪酸标准储备液。做标准曲线时，分别将不同的脂肪酸储备液稀释后配成0.1、0.2、0.6、1.0、1.5、2.0、2.5mg/m L等浓度系列的标准溶液。

1.2.2 蚕蛹油水解后脂肪酸样品制备 取蚕蛹油水解样品0.1g，精密称定，配制成1.0mg/m L的样品溶液，待测。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Hanbon Lichrospher C18柱（5μm，250mm×4.6mm）；流动相A：丙酮；流动相B：水（2%乙酸）；梯度洗脱程序：0～25min，65%A～80%A；流速：1.0m L/m in；柱温；30℃；进样量：20μL；检测器参数：增益100，漂移管温度50℃，雾化器级别50%，N2压力25.0psi。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 流动相对蚕蛹油中脂肪酸分离的影响

图1 不同流动相及洗脱方式下三种脂肪酸的液相色谱图Fig.1 Chromatogram of differentmobile phase for the separation of 3 fatty acids

2.1.1.1 流动相种类 通常用于分离脂肪酸的流动相包括乙腈、甲醇、丙酮、异丙醇、氯仿，常用的组合有甲醇-水（1%乙酸）[11]、乙腈-水（0.1%乙酸）-二氯甲烷[12]。比较丙酮-乙腈、丙酮-甲醇、丙酮-水（丙酮80%）为流动相时对三种脂肪酸的洗脱效果，发现前两种流动相不能使棕榈酸和油酸相互分离（图1-a），亚麻酸与其他脂肪酸分离较好；采用后一种流动相时，棕榈酸和油酸色谱峰有分离趋势但没有实现基线分离，亚麻酸与其他脂肪酸分离较好（图1-b）。故选择丙酮-水为流动相，进一步考察不同流动相配比对棕榈酸和油酸分离效果的影响。

2.1.1.2 流动相配比 首先考察不同比例丙酮-水为流动相（丙酮80%、70%、60%）等度洗脱时，棕榈酸和油酸分离的影响。发现降低丙酮浓度，两种脂肪酸的分离度增加、响应值减小；当丙酮浓度为60%时，两种脂肪酸仍没有实现基线分离、响应值达到最低。

其次考察丙酮（A）+水（B）为流动相，以下梯度洗脱程序对棕榈酸和油酸分离的影响。梯度1：0～15min，65%A～80%A；梯度2：0～25m in，65%A～80%A。发现采用梯度1（图1-c）时，两种脂肪酸有分离趋势但没有达到基线分离；采用梯度2时，两种脂肪酸达到基线分离。最终确定梯度2为脂肪酸色谱分离条件（图1-d）。

2.1.2 流速对蚕蛹油中脂肪酸分离的影响 其他色谱条件不变的情况下，比较了流速0.6、0.8、1.0、1.2m L/m in时混合脂肪酸的色谱图，结果表明，流速小于1.0m L/m in时，脂肪酸分离时间较长，响应值也逐渐减小，但各脂肪酸分离效果没有提高；当流速大于1.0m L/min时，脂肪酸分离时间短，响应值和相对分离效果不变。确定最终流速为1.0m L/m in。

2.1.3 柱温对蚕蛹油中脂肪酸分离的影响 其他色谱条件不变的情况下，比较了柱温30、40、50℃时的分离情况，结果见图2，发现柱温升高，脂肪酸的分析时间提前，响应值增加，但基线噪音也同时增大。当柱温为30℃时，各脂肪酸峰形较好，响应值也较高，因此固定柱温为30℃。

图2 不同柱温下三种脂肪酸的液相色谱图Fig.2 Chromatogram of different temperature for the separation of 3 fatty acids

2.1.4 乙酸含量对蚕蛹油中脂肪酸分离的影响 流动相中加入乙酸能够抑制羧基的质子化，从而改善脂肪酸出峰晚、响应值低、峰塌陷等问题[5，13]。本文比较了乙酸含量0.05%、1%、2%时的分离情况，结果见图3，乙酸含量0.05%时，样品的响应值较小，乙酸含量2%时，各组分的响应值较大，分离效果也较好，因此固定乙酸含量为2%。

通过以上研究，确定蚕蛹油主要脂肪酸定量分析色谱条件为：色谱柱：Hanbon C18柱（5μm，250mm× 4.6mm）；流动相A：丙酮；流动相B：水（2%乙酸）；洗脱程序：0～25m in，65%A～80%A；流速1.0m L/m in；ELSD检测器。该条件下，各脂肪酸的保留时间范围分别为：亚麻酸（20.8～21.6min）、棕榈酸（27.6～28.4min）、油酸（28.5～29.3m in）。

图3 不同乙酸含量下三种脂肪酸的液相色谱图Fig.3 Chromatogram of different Acetic acid concentration for the separation of 3 fatty acids

2.2 蚕蛹油中脂肪酸定量分析

2.2.1 标准曲线的绘制 在上述色谱条件下分别对三种脂肪酸标准溶液进行检测，对各组分峰面积及浓度取自然对数后线性回归，绘制工作曲线，得回归方程、相关系数及线性范围（见表1）。

表1 蚕蛹油中三种脂肪酸的线性方程及线性范围Table1 Calibration curves and limits of detection for 3 fatty acids in pupa oil

由表1可知，本法所测三种脂肪酸的线性回归方程的R2均＞0.99，线性关系良好，满足脂肪酸样品的定量测定。

2.2.2 方法精密度及加样回收率测定 为检测分析方法的重复性，三种脂肪酸分别选择两个浓度，平行进样6次，按实验方法1.2.3中色谱条件测定各脂肪酸含量，结果见表2。多次测量结果的相对标准偏差（RSD）均小于2%，证明本方法的精密度较高。

用1.2.2方法配制一定浓度蚕蛹油水解后脂肪酸样品，按表3所示添加脂肪酸标准品，进行加样回收率实验。通过计算回收率及相对标准偏差（RSD），评价方法的准确性，结果见表3。

表2 精密度实验结果Table2 Reproducibility（RSD%）of the 3 fatty acids using the HPLC-ELSDmethod

表3 加样回收率实验结果Table3 Recovery of the 3 fatty acids using the HPLC-ELSDmethod

由表3可知，三种脂肪酸的加样回收率在97%～107%之间，RSD在0.4%～2.0%之间，说明本方法可靠，测定准确度较高。

2.3 对照实验

分别采用本方法和国标方法GB/T 17377-2008对蚕蛹油中三种脂肪酸进行测定，每种方法测定3次，结果见表4。

经F检验和T检验，方法的检测结果无显著性差异。本方法与传统国标法[14]相比，样品处理过程简化，进样前无需甲酯化，定量分析时不需要校正因子和内标物，一定程度上提高了测定结果的准确性。本方法与国标规定的方法对蚕蛹油中脂肪酸的检测结果基本一致，可用本方法代替国标法对蚕蛹油总脂肪酸进行分析检测。

3 结论

本文建立了一种检测蚕蛹油中三种主要脂肪酸的HPLC-ELSD方法。以丙酮-水（2%乙酸）（v∶v）为流动相，梯度洗脱，亚麻酸、棕榈酸和油酸实现基线分离，三种脂肪酸的线性范围分别为0.2～2.0mg/m L、0.1～2.0mg/m L，0.2～2.5mg/m L，线性关系良好，回收率为97%～107%，RSD均＜2%，该方法重复性好，适用于蚕蛹油中主要脂肪酸的分析检测。

表4 两种方法测定结果比较Table4 Comparison of themeasurement results of the twomethods

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