TaqMan实时荧光RT-PCR检测猪脑心肌炎病毒方法的建立与应用

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（上海出入境检验检疫局，上海 200135）

TaqMan实时荧光RT-PCR检测猪脑心肌炎病毒方法的建立与应用

张强，王巧全，熊炜，李树清，李健，林颖峥，黄忠荣

（上海出入境检验检疫局，上海 200135）

针对猪脑心肌炎病毒（EMCV）基因组保守区域，设计并合成了特异性引物和TaqMan探针，建立了EMCV的TaqMan 实时荧光定量 RT-PCR方法。通过常规RT-PCR方法扩增EMCV保守序列并将其连入pMD19-T载体，制备阳性标准质粒，优化反应条件，以10倍梯度稀释的标准品绘制标准曲线，EMCV标准曲线的相关系数为0.999。结果显示，该方法检测灵敏度达到10拷贝/μL，对猪捷申病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒检测结果均为阴性。方法重复性好，批内和批间变异系数均小于2%。检测采集自上海供港猪场、进境美国种猪、加拿大、法国种猪的血清样本145份，EMCV核酸的检出率国内猪场53.6%，美国猪检出率为27.6%，加拿大猪检出率为20%，法国猪检出率为26.7%。EMCV实时荧光RT-PCR方法的建立为该病的快速诊断和流行病学调查提供了有效手段。

猪脑心肌炎病毒；实时荧光 PCR；TaqMan探针

脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）是一种重要的共患病病原，可以引起猪及某些哺乳动物乃至灵长类动物的一种以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要特征的急性传染病。1958年，巴拿马首次报道EMCV能够感染猪并引起猪急性致死性心肌炎[1]。后来发现EMCV与猪的繁殖障碍也有关联[2]。现在世界上主要养猪国家都有该病流行的报道[3]。我国于2005年首次从病死仔猪和流产胎儿中分离到EMCV[4]，证实国内猪场存在该病。规模化猪场血清学调查表明，我国猪场普遍感染EMCV，血清抗体阳性率很高[5]，猪脑心肌炎已成为危害我国养猪业健康发展的重要隐患。

EMCV感染很常见，但临床症状却很少见，常呈亚临床状态。实验经口感染仔猪，接种6小时即可在肠道检测到病毒；接种后3天，可在肝脏、肾脏、脾脏和肺脏分离到病毒[6]。因此，在EMCV隐性感染和感染早期诊断该病具有重要意义。猎人及动物园兽医虽可感染EMCV，并产生特异性抗体[7-8]，但其公共卫生影响并未受到重视。近年随着异种器官移植的兴起，猪作为人类器官移植的重要供体动物，EMCV对人类健康的隐患受到越来越多的关注[9]。因此，亟待建立敏感、特异、快速的检测方法来诊断该病。本研究采用Taqman探针技术，建立了EMCV实时荧光RT-PCR方法，为EMCV快速诊断提供了有效的技术平台。

1 材料与方法

1.1 血样和毒株 检测血样采集自上海郊区某猪场，从美国、加拿大和法国引进的种猪；猪脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）、猪捷申病毒（porcine teschovirus，PTV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）由本实验室保存。

1.2 试剂和仪器 Ex Taq DNA聚合酶、Premix Ex Taq （Probe qPCR）、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs、DNA Marker、pMD19-T载体等购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒和DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司；RNA提取试剂盒（Cat No.74106）购自Qiagen有限公司。主要仪器为ABI ViiA 7荧光定量PCR仪。

1.3 引物和探针 应用BioEdit 软件对实验室分离毒株及GenBank 数据库中的EMCV基因序列进行同源性比对， 利用Beacon Designer软件在EMCV基因组保守区域设计并合成一对特异性引物和TaqMan 荧光探针。 探针的5'端标记的荧光报告基团是FAM， 3'端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。EMCVFP：5’-GGGATCAGCTTTTACGGCTTT-3’，EMCVRP：5’-CCCATGCATCCGATAGAGAAC-3’，EMCV Probe：5’（FAM）CGATGCCAACGAGGACGCCC（TAMRA）3’， 扩增片段长度为95bp。 另外， 针对EMCV保守区域设计了一对常规RT-PCR引物用于制备阳性质粒， 引物序列为EMCVF：5'-CATTGAGACAAATCCAGGGCC-3'，EMCVR：5'- ATCTGCTCAAGAGCTGCTTCC-3’，产物286bp。 引物和探针由英维捷基（上海）公司合成。

1.4 病毒基因组RNA的提取 按照Qiagen公司RNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取病料组织中的病毒基因组RNA。

1.5 阳性标准质粒的制备 以EMCVF和EMCVR为引物，扩增EMCV基因保守序列区，扩增片段长度为280bp。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min。反应结束后，取5μL PCR 产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果。胶回收目的片段，连入pMD19-T载体，转化至DH5α感受态细胞中，提取质粒进行PCR鉴定和序列测定，获得测序完全正确的质粒pMDEMCV作为阳性标准质粒，质粒用NanoDrop（Thermo Scientifc）微量分光光度计测量OD260，根据公式计算出质粒标准品的拷贝数。质粒-20℃保存备用。

1.6 标准曲线的绘制 用无RNA酶水对阳性标准质粒进行10倍系列稀释，取5个稀释度作为标准模板，优化引物和探针的浓度、Tm值及反应时间，进行荧光定量RT-PCR反应，计算Ct值并绘制标准曲线。

1.7 特异性试验 应用建立起来的荧光定量RTPCR方法对PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV进行特异性试验。

1.8 敏感性试验 用107拷贝/μL阳性标准质粒做荧光定量PCR，进行敏感性试验。

1.9 重复性试验 取3份病毒含量不同的样品进行批间重复性试验和批内重复性试验。

1.10 病料的检测 应用建立起来的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法，对145份采自上海郊区某猪场从美国、加拿大、法国引进的种猪血清样品进行检测。

2 结果

2.1 标准质粒的制备

以提取的细胞毒总RNA反转录获得的cDNA为模板进行常规PCR扩增，PCR产物经1%浓度琼脂糖凝胶电泳后，可见约280bp的基因片段，与预期基因片段的大小相一致（图1）。回收该目的基因片段，将其连入pMD19-T载体，测序结果表明扩增获得的目的基因片段与毒株已知序列同源性为100%，可用作标准质粒。经分光光度计测定，计算得出标准质粒的浓度为1.88×1010拷贝/uL。

图1 EMCV基因的RT-PCR扩增

2.2 标准曲线的建立

将pMDEMCV质粒经10倍系列稀释至1.88×103～1.88×107拷贝/μL共5个浓度作为标准品，每个浓度的标准品做3个重复进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为20μL， 包括2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）10μL，上、下游引物（10 pmol/ L）各0.8μL，探针（10 pmol/L）0.8μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，模板（质粒或cDNA）2μL，DEPC 水5.2μL 。反应条件为：95℃变性 40s；以95℃变性20 s，56℃退火延伸25 s， 45个循环扩增；在56℃采集荧光。结果pMDEMCV的各浓度均有很好的线性关系，阴性对照无扩增反应，其相关系数R2=0.999， 扩增效率E=98.11%（图 2 a 和b）。

2.3 敏感性与特异性试验

将阳性质粒pMDEMCV按照101-1012梯度稀释作为模板，进行TaqMan 实时荧光定量RTPCR 检测， 最低检出量为10 拷贝/μL（图3）。以对照病毒PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV和EMCV用建立起来的荧光定量RT-PCR做检测，结果显示针对EMCV的检测方法检测PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV均为阴性（图4），说明本方法特异性很好。

图2实时荧光定量PCR检测EMCV的动力学曲线（a）和标准曲线（b）

图3 Taqman实时荧光定量PCR检测EMCV的敏感性试验

图4 Taqman实时荧光定量RT-PCR检测EMCV的特异性试验

2.5 重复性试验

对含量不同的3份EMCV感染样品做5个批内重复和批间重复，变异系数均小于2%，表明该方法重复性良好（表1）。

表1 实时荧光定量RT-PCR 检测EMCV批内及批间重复试验结

2.6 临床样品检测

应用建立的TaqMan 实时荧光定量RT-PCR方法，检测采集自上海郊区某猪场，从美国、加拿大、法国引进种猪的血清样本共计145份，结果显示供港猪场样品30份阳性（30/56），美国种猪8份样品阳性（8/29），加拿大种猪6份阳性（6/30），法国种猪8份阳性（8/30）（表2）。

表2 应用荧光定量RT-PCR 检测猪血清样品中EMCV 的结果

3 讨论

目前， EMCV的分子检测方法主要有普通PCR和实时（Real-time）PCR。Real-time PCR秉承及发展了普通PCR的快速、高灵敏度检出等全部优点，同时克服了普通PCR不能准确定量、容易污染等不足，可以说Real-time PCR使PCR技术发生了质的飞跃，扩展了PCR技术的应用范畴，逐渐成为动物疫病诊断的主要方法。Real-time PCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的，其荧光检出方法可分为荧光嵌入法（SYBR Green I）和荧光探针法两种。由于SYBR Green I定量PCR体系中使用的SYBR Green I染料非特异性结合双链DNA，染料分子除了与特异性的靶序列扩增产物结合外，还能与反应体系中的引物二聚体、污染的基因组DNA、PCR扩增过程中形成的非特异性扩增产物结合，容易出现假阳性结果。特异性强是荧光探针法无可替代的优点。

本研究建立了针对EMCV的基于Taqman探针的实时荧光定量RT-PCR 方法，通过特异性、敏感性和重复性试验检验，结果表明，该方法均具有较高的敏感性，最低可检测到10 拷贝/μL 的阳性标准品；特异性强，对EMCV检测结果为阳性，但对其他常见猪源病毒PTV、PRRSV、CSFV、JEV、TGEV的检测结果均为阴性；重复性好，对含有EMCV的3份病毒样品进行5 个批内重复和批间重复试验，变异系数均小于2%。应用建立的TaqMan 实时荧光定量RT-PCR方法，检测采集自上海郊区猪场，美国、加拿大、法国进境种猪血清样本共计145份，共检出52份阳性样品，证明该方法可靠。EMCV Taqman实时荧光定量RT-PCR方法的建立，为EMCV快速诊断及EMCV准确定量提供了有效的技术平台。

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Development and Application of Taqman Real-time RT- PCR Assay for Detection of Porcine Encephalomyocarditis Virus

Zhang Qiang， Wang Qiaoquan， Xiong Wei， Li Shuqing， Li Jian， Lin Yingzheng， Huang Zhongrong（Shanghai Entry-Exit Inspection and Qarantine Bureau，Shanghai，200135）

A Taqman real-time fuorescence quantitative PCR was established using primers and probe based on the conserved region of encephalomyocarditis virus（EMCV） genomes. The amplifcation sequence of EMCV was cloned into the pMD19-T vector and a series of diluted recombinant plasmid was used to generate standard curves. The real-time quantitative PCR assay could detect as less as 10 copies of target cDNA of EMCV. The assay showed good specifcity with negative reactions for other porcine viruses（PTV，PRRSV，CSFV，JEV and TGEV）. The variation coeffcient of intra-batch or inter-batch was below 2%，indicating good reproducibility. 145 serum samples of pigs from domestic farms and USA，Canada，France were detected by the real-time PCR，and the results showed that 53.6%，27.6%，20%and 26.7% of the sample were positive for EMCV respectively. The method can be used for EMCV infection investigation.

encephalomyocarditis virus； real-time fuorescence quantitative PCR； Taqman probe

S852.659.5； S858.23

：A

：1005-944X（2014）05-0081-04

上海检验检疫局科技项目（HK012-2010）