nm23-M1基因在小鼠粒单核细胞白血病中的表达

董 征, 孙雪冬, 满秋红, 姚 波, 李玉芳, 刘铁强, 黄 珊, 刘广贤, 艾辉胜, 郭 梅

(解放军307医院, 北京 100071)

nm23-M1基因在小鼠粒单核细胞白血病中的表达

董 征, 孙雪冬, 满秋红, 姚 波, 李玉芳, 刘铁强, 黄 珊, 刘广贤, 艾辉胜, 郭 梅

(解放军307医院, 北京 100071)

目的 探讨nm23-M1基因在小鼠粒单核细胞白血病中的表达。方法 给小鼠经尾静脉注射粒单核细胞白血病细胞株WEHI-3,同时选取正常小鼠作为对照组，取发病小鼠以及正常小鼠的骨髓,采取qRT-PCR的方法检测nm23-M1基因的表达情况，分析其与白血病发生及发展的关系。结果 粒单细胞白血病小鼠骨髓细胞中nm23-M1基因的相对表达量是正常对照组中的24倍,两组之间有显著性差异(P＜0.05)。结论 nm23-M1基因在小鼠粒单核细胞白血病中高表达,并且与外周血白细胞数、骨髓原始细胞数以及脏器白血病侵袭情况相关，而与白血病小鼠的性别、年龄无关。

nm23-M 1基因; 粒单核细胞白血病

分化抑制因子nm23基因最先由美国国立癌症研究院Steeg等[1]于1988年将轻度和高度转移黑色素瘤细胞的cDNA文库进行差异杂交后发现。人类nm23基因有nm23-H1和nm23-H2两种亚型，两者具有88%的氨基酸序列同源性，两基因都定位于17号染色体长臂2区1带同一区域，呈串联排列[2]。而鼠类的nm23-M 1基因定位于11号染色体短臂1区3带, 与人类nm23-H1有98%的同源性, 和nm23-H2有88%的同源性。nm23基因在正常细胞和血液系统恶性肿瘤细胞的生长和分化中都起了重要作用[3～5]。nm23基因抑制了多种白血病细胞的分化如:小鼠的髓系白血病M 1、WEHI-3以及人类白血病HEL,KU812,K562[6]。而nm23-M 1基因在白血病小鼠体内的表达研究甚少。本文主要研究nm23-M 1基因在WEHI-3白血病小鼠体内的表达情况，分析其与疾病的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

选用6～8周龄SPF级BALB/c小鼠40只雌雄各半，体质量20±1 g，购自军事医学科学院实验动物中心[SCXK(军)2007-004]) 。小鼠粒单核细胞白血病细胞株WEHI-3 购自协和医科大学基础研究所细胞中心。逆转录体系及PCR 扩增体系(日本TaKaRa 公司产品), 基因引物及探针均由日本TaKaRa公司合成。实时荧光定量PCR仪MX3005P为美国Stratagene公司产品。

1.2 实验设计

BALB/c小鼠分为2组，一组正常小鼠作为对照组，另一组为白血病小鼠经由尾静脉接种1×106个WEHI-3 细胞，在接种后2周，脱臼处死小鼠提取骨髓组织进行检测。注射后观察小鼠饮食体质量、毛色、活动度等一般指标，对濒死小鼠进行血常规、骨髓涂片、病理组织检测以验证白血病小鼠模型的可靠性。

1.3 骨髓单个核细胞总RNA的提取

取白血病小鼠和正常小鼠的骨髓样品。用红细胞裂解液裂解红细胞，离心洗涤后得单个核细胞，TRIzol法裂解细胞，提取总RNA，DEPC水溶解，分光光度计测OD值在1.8～2.0 ，用TOYOBO逆转录试剂盒逆转录为cDNA，-20℃保存备用。

1.4 样本cDNA的制备

取DEPC处理过的PCR管，按逆转录试剂盒说明，1μl Oligol随机引物加5 ng～2 μg的RNA模板，用无RNA酶的水补足到10 μl，70℃温育5 min后置于冰上，依次加入5μl缓冲液，8μl dNTP，1 μl RNA酶抑制剂，1μl逆转录酶，37℃温育1 h。cDNA标本放置-20℃备用。

表1 引物及探针的序列和长度

1.5 引物和探针的设计

Genbank查阅各个基因序列，在基因跨内含子区域应用Beacon Designer 7.0设计软件设立上下游引物和探针，之后在NCBI网络上用BlastResearch分析其特异性(表1)。

1.6 实时荧光定量PCR扩增

采用美国STRATAGENE公司生产的MX3005P实时荧光定量PCR仪进行PCR的扩增及结果分析。反应体系25 μl，含10×PCR缓冲液2.5 μl，dNTPs 2.5 μl, 上下游引物2 μl, ddH2O16.5 μl, 探针0.3 μl，HOTSTART TagDNA多聚酶0.125 μl(TAKARA)及模板1 μl。将上述试剂加入0.25 m l的PCR管中，轻弹混匀，短暂离心后进行扩增。运行参数: 95℃ 预变性10 min; 95℃ 变性30s，59℃退火30 s, 72℃延伸30 s，共反应40个循环，在每一个循环的退火温度时搜集荧光信号进行实时检测。

将PCR 扩增产物进行琼脂糖电泳验证目的条带，并进一步将扩增产物纯化后连接到T 载体，然后转化E．Coli DH5a 感受态细胞，筛选出阳性克隆，经测序鉴定后进行质粒抽提，测定质粒浓度，计算质粒拷贝数，然后进行10倍序列的稀释，构建质粒标准品并制作标准曲线。通过与标准曲线比对计算出基因拷贝数，根据双标准曲线法推算出各基因表达率。

1.7 统计学分析

采用SPSS13.0软件进行统计学分析。白血病组与对照组的nm23-M 1基因表达差异为定量资料,应用One-Way ANOVA 进行检验, 方差齐性检验不齐, 选用Dunnett，ST3 法进行比较。nm23-M 1 基因表达水平、外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板量、体质量之间的相关性应用Spearman相关分析; 所有分析均设定P值为双侧分布, 以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Real-time PCR可靠性验证

选取目的基因质粒10倍稀释后，分别将107，106，105，104，103，102的质粒进行扩增，绘制标准曲线，每条标准曲线的相关系数R2均大于0.99，证明循环阈值与标准质粒DNA的LOG值呈线性相关。目的基因与管家基因β-actin差值较小，表明扩增效率一致性好(图1)。

2.2 nm23-M 1在白血病组小鼠和正常对照组小鼠

体内表达的定性检测

取两只白血病小鼠和两只正常小鼠的骨髓, 提取RNA后进行PCR扩增, L1、L2代表白血病小鼠，N1、N2代表正常小鼠。结果显示白血病小鼠和正常小鼠均表达nm23-M 1基因，但是荧光强度不同，提示nm23-M 1在白血病小鼠中高表达(图2)。

2.3 nm23-M 1在白血病组小鼠和正常对照小鼠体

内表达的荧光相对定量检测

图1 nm23-M 1基因质粒的实时荧光定量PCR扩增曲线

图2 nm23-M 1在正常和白血病小鼠中的表达情况

扩增效率(E)由等式E=10(-1/斜率)计算得出。△Ct是指参照标本与待测标本的Ct值差异。两组之间进行非参数检验，与正常对照组nm23-M 1相对表达量(2.05±1.26)比较, 白血病组nm23-M 1基因表达(48.73±64.31)显著升高(P＜0.05)。证明nm23-M 1基因表达的高低与白血病疾病是相关的。

2.4 白血病小鼠中nm23-M 1基因的表达情况与其他因素的相关性

nm23-M 1基因与外周血白细胞数、骨髓原始细胞数以及脏器白血病侵袭情况相关，而与白血病小鼠的性别、年龄无关(表3)。

3 讨论

研究表明，nm-23基因与肿瘤细胞的生长、分化密切相关。但nm23基因在人类不同类型的肿瘤中有着不同的功能[7～10]。在血液系统恶性肿瘤中，包括AML，ALL，MDS, CML, 淋巴瘤, nm23-H1基因均有表达，并且有研究显示其可以作为预后的标志[11～13]。在对110个AML患者的nm23基因的表达情况与临床各项指标的相关性分析中，nm23-H1的表达增加会增加初始化疗的耐药性并使总的存活率降低[14]。所以，在AML患者中nm23-H1是个重要的预后指标。随着近年来对小鼠白血病模型的建立，研究更加深入，但基因方面的研究较少。

在本实验中，检测了20只粒单细胞白血病小鼠骨髓细胞中nm23-M 1基因的相对表达量均值是正常对照组中20只小鼠骨髓中nm23-M 1基因的相对表达量的均值的24倍，两组之间有显著差异。结果表明nm23-M 1的表达增高与小鼠粒单细胞白血病相关。因为nm23-M 1基因在一些人类的实体肿瘤以及血液系统恶性肿瘤中的表达与肿瘤的高转移性和侵袭性相关，作者考虑nm23-M 1基因的表达可能与肿瘤本身的一些特性有关，所以将nm23-M 1基因的表达与粒单细胞白血病小鼠的性别、年龄、外周血白细胞数、骨髓原始细胞数以及脏器白血病侵袭情况做了相关性分析，结果显示nm23-M 1基因与外周血白细胞数、骨髓原始细胞数以及脏器白血病侵袭情况相关，而与白血病小鼠的性别、年龄无关。因为白血病本身的特性，骨髓中白血病细胞不断增殖，抑制其他血细胞增殖，越到疾病晚期外周血中白细胞数目增高越明显，骨髓中白血病细胞比例越高，并且通过血液系统转移到其它脏器中。综上考虑，nm23-M 1在粒单细胞白血病小鼠中的表达与那些能反应白血病恶性程度、白血病侵袭情况相关。而当小鼠体内存在少量白血病细胞不足以发病的时候，nm23-M 1基因表达不增高，所以不能作为残留白血病的标志。在小鼠发病以后，nm23-M 1基因表达增高可以作为一个辅助诊断小鼠粒单白血病的标志和判断预后的标志。

表3 nm23-M 1表达与临床各因素相关性统计表

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Expression of nm23-M1 Gene in Mouse Myelomonocytic Leukemia

DONG Zheng, SUN Xue-dong, MAN Qiu-hong,YAO Bo, LI Yu-fang, LIU Tie-qiang, HUANG Shan, LIU Gguang-xian, AiHui-sheng, GUO Mei
(307 Hospital of PLA, Beijing 100071, China)

ObjectiveTo investigate the expression level of nm23-M 1 gene in mouse myelomonocytic leukemia.M ethodsThe mice were inoculated intravenously w ith myelomonocytic leukemia cells of WEHI-3 cells, and selected a control group of normal mice. Bone marrow samples were collected in two groups. The nm23-M 1 mRNA expression were detected by TaqMan quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR) and analysis of its relationship w ith the occurrence and development of leukemia. ResultsThe expression of nm23-M 1 gene in bone marrow cells of mice w ith leukemia is 24 times of the normal control group. There was a significant difference between the two groups (P＜0.05).ConclusionThe nm23-M 1 gene overexpressed .in mouse myelomonocytic leukemia, and had close relationship between and peripheral white blood cell count, the number of original cells in bone marrow and organ against the leukemia cases, regardless of the gender, age and leukemia in mice.

nm23-M 1 gene; Myelomonocytic leukemia

Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0042-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.06.008

2013-06-03

董 征(1983-), 男, 医师, 解放军307医院血液内科, E-mail: dongz1983@139.com

郭 梅, 副主任医师, 解放军307医院血液内科, E-mail: guomei307@163.com