恶性间皮瘤的分子生物学研究进展

姚银丽 徐伟珍 毛伟敏

恶性间皮瘤(malignant mesothelioma，MM)是一种高侵袭性的肿瘤，预后极差。石棉暴露是目前认为与间皮瘤发生、发展较为密切的致病因素。由于20世纪50～70年代石棉材料的广泛应用，我国间皮瘤的发生率有上升趋势，为(0.1～0.6)/10万，由于我国的人口基数庞大，总的发病人数多于其他国家。目前治疗恶性间皮瘤的疗效不佳，大部分患者发现时已无手术机会。肿瘤的快速进展以及目前尚无明确有效的治疗方案使得MM患者的中位生存期只有12个月。虽然距离MM首次报道已经过去50多年，但目前仍没有建立起最优治疗策略，对MM的诊断、分期以及治疗仍然困难重重。近几年来，对恶性间皮瘤的分子生物学研究逐渐成为热点。检测MM发生、发展过程中基因表达改变，抑癌基因和癌基因的变异，以及研究高危人群致癌过程的有效标志物，将对MM的诊断、治疗及预后具有重要的意义。本文就恶性间皮瘤流行病学特征、潜在分子靶点的发现及研究进展做一综述。

一、恶性间皮瘤的流行病学特征

恶性间皮瘤是一种来源于间皮细胞的原发肿瘤，它可发生在胸膜、心包膜、腹膜和卵巢上皮细胞，其中恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM)发生率约占间皮瘤的70%[1]。在组织病理学上分为上皮型、肉瘤型、混合型(双向型)3大类，预后均极差。石棉暴露是目前认为与间皮瘤发生、发展较为密切的致病因素。自从1960年，Wagner首次报道石棉接触与MM的相关性后，陆续有研究证实世界上石棉采矿工人MM高发，有石棉暴露史的人群中MM的发生率可达到100/(百万·年)，而正常人群中MM的发生率只有1/(百万·年)，且由于职业因素，男性MM的发生率远高于女性。石棉已被国际癌症研究中心(IARC)确认为致癌物。石棉纤维暴露可诱发间皮细胞内DNA损伤及染色体异常[3]。间皮细胞能吞噬石棉纤维，石棉纤维与染色体或纺锤体缠绕，干扰有丝分裂过程，导致染色体结构异常和间皮细胞内非整倍体的形成。石棉纤维能吸收各种蛋白质和化学物质于表面，导致有害物质的积累，其中包括致癌物。石棉纤维还结合重要的细胞蛋白，对于正常间皮细胞，这些蛋白的缺失可能是有害的。体内研究发现，石棉纤维暴露后引发由大量单核-吞噬细胞组成的炎性反应，巨噬细胞吞噬纤维，但不能将其消化，并释放各种细胞因子和生长因子，从而诱导炎症和肿瘤的产生[4]。

最近研究发现，肿瘤坏死因子α及NF-κB通路在石棉致间皮瘤发生、发展过程中起了关键作用[5]。接触石棉到MM的确诊有40年的潜伏期[6]。因此，在该潜伏期内，防止石棉采矿工人再次接触石棉，在很大程度上可能降低其发生率及病死率。虽然许多发达国家及一些发展中国家已禁止石棉的生产及销售，但由于潜伏期的影响，近几年MM的发生率及病死率仍呈不断上升趋势。作为世界上最大的石棉消费国，不久的将来，中国可能会遭遇MM的发病高峰。尽管关于石棉如何致MM发生的可能机制已被探讨，但准确的发病机制仍需要进一步探索。除石棉暴露以外，目前还发现放射线照射、接触其他矿产纤维如毛沸石、感染SV40病毒以及遗传易感性也是MM发生、发展的可能原因。

二、恶性间皮瘤诊断与治疗的潜在分子靶点研究进展

恶性间皮瘤在临床表现上无特异性，易误诊，大多数MM患者在确诊时已是晚期，失去手术切除机会，故预后极差。目前对MM没有明确有效的治疗方法，放疗受限于肿瘤体积大，很难达到根治量。作为一线化疗方案，培美曲塞与顺铂的联合治疗提高了部分患者的存活率，但远期生存率仍较差。因此，寻找恶性间皮瘤诊断与治疗的潜在分子靶点具有重要意义。

基于分子生物技术的不断发展，对间皮细胞恶性转化中分子事件的研究逐渐增多。人们通过细胞遗传学分析染色体核型、比较基因组杂交技术和单核苷酸多态性分析等方法发现，恶性间皮瘤中存在杂合子的缺失，且检测到染色体臂的 1p-、3p-、4p-、4q-、6q-、9p-、13q-、14q-、15q-和 22q-这些区域发生频繁缺失[7]。MM细胞系与人肿瘤组织存在共同的染色体突变区域。然而一些研究者发现，由于人肿瘤组织中存在少量的正常组织，结果显示MM细胞系在这些染色体区域突变的频率要高于人肿瘤组织。此外，研究还发现在这些区域存在着较重要的肿瘤抑制基因，他们包括在染色体17p13上的p53基因、9p21上的p16INK4a/p14ARF基因和位于22q12的神经纤维瘤病Ⅱ型(neurofibromatosis type 2，NF2)基因。这些抑癌基因的失活，可能在MM的发生和发展中发挥着重要作用。

1.p53与间皮瘤:p53基因是一种抑癌基因，定位于人类染色体17p13.1，主要通过抑制细胞的增殖及促进细胞凋亡来稳定基因组、抑制突变细胞的产生。p53基因突变可促进细胞进入持续的分裂状态，抑制细胞凋亡，导致肿瘤的产生。在人类恶性肿瘤中普遍存在p53基因的突变，而在MM中，只有20%的患者发生该基因突变，突变率较其他恶性肿瘤明显偏低[8]。但进一步研究发现，其他途径也可导致p53基因的表达异常。

通过荧光原位杂交(FISH)分析发现，50%～70%的恶性间皮瘤及培养的MM细胞系中存在纯合子p16INK4a/p14ARF的缺失，影响两条抑癌通路p53和成视网膜细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)的失活导致恶性胸膜间皮瘤的发生，并提示预后不良[9]。INK4a/ARF基因定位于人类染色体 9p21，是重要的细胞周期调控基因，其表达产物p16INK4a和p14ARF蛋白分别在pRb和p53通路中发挥重要调节作用。p16INK4a是细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent protein kinases，CDK)的抑制剂，通过失活CDK4/CDK6抑制蛋白质pRB的磷酸化，减少转录因子 E2F的释放，将细胞阻滞于 G1期。而p14ARF是在细胞DNA损伤后通过加速泛素蛋白连接酶(murine double minute 2，MDM2)的降解，导致抑癌基因p53水平升高，抑制细胞异常分裂，并促进细胞凋亡。最近的动物实验发现，鼠 p16INK4a/p19ARF，与人p14ARF同源，缺失其中一个基因会对石棉诱导的MM易感，若两个基因都缺失，则会加速石棉对肿瘤的诱导作用[10]。p16INK4a/p14ARF基因可以用来预测恶性间皮瘤的发生。

2.PTEN与间皮瘤:磷酸酶-张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)定位于染色体 10q23，基因全长200kb，编码5.5kb的mRNA。研究发现，PTEN基因在人染色体10q23频繁缺失，与肿瘤的发生密切相关。约50%～80%的单等位基因突变存在于散发性肿瘤，30%～50%发生在乳腺癌、结肠癌和肺癌，而在子宫内膜癌及成胶质细胞瘤中纯合性缺失更常见，且与较差的预后和转移有关[11]。目前有关PTEN与恶性间皮瘤的报道较少，且存在一定的争议。

Agarwal等[12]的一项研究收集86例MM标本，结果显示只有26.7%的标本PETN基因表达缺失，而超过26.7%的标本显示PTEN基因低表达。第2项研究用21株MM细胞株进行筛选，发现只有2株细胞株PTEN基因表达缺失，而与正常间皮细胞株MET5a相比，7株细胞显示PETN基因低表达。另一方面，Opitz等[13]纳入341例MM患者进行研究，其中发现62%的患者PTEN表达缺失，并提示较差的存活率。因此，在恶性间皮瘤中PTEN基因表达缺失或低表达，仍需大量研究确认。

PI3K/AKT抑制剂:PTEN基因还是人类发现的第1个具有磷酸化酶功能的抑癌基因。PTEN通过使PIP3脱磷酸化为PIP2，而成为PI3K/AKT信号转导通路的主要负调控因子。PTEN表达的下降，将导致PIP3的过表达，进而活化AKT和3'磷酸肌醇依赖的激酶 1(3'-phosphoinositide-dependent kinasel，PDK1)，PDK1是一个63kDa的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白酶，它是AKT的上游活化激酶。PDK1可在磷酸化AKT的Thr308位点使AKT的活性增加30倍以上，促进细胞异常增殖。因此，通过药物抑制PI3K/AKT信号通路，可抑制肿瘤的生长。然而1993年研发的PI3K/AKT抑制剂LY294002被报道特异性差，毒性不良反应大。此后，新的PI3K/AKT抑制剂不断被研发。目前，新药哌立福在Ⅲ期临床试验中被用于治疗多发性骨髓瘤和大肠癌[14]。临床上也尝试用PI3K/AKT抑制剂来治疗恶性间皮瘤，但缺少大规模的临床试验。

在核内，PTEN能调节Rad51的表达，减少自发性DNA双链断裂，从而维持染色体的完整性[15]。PTEN还能与p53结合成复合体，在DNA损伤时，保持p53的高乙酰化状态，调节p53的稳定性及活性。而研究发现，这种机制与上述所讲的磷酸化过程完全独立[16]。此外，AKT通过在Ser166和Ser186位点磷酸化MDM2，使其进入细胞核内，从而导致p53的恒定失活。因此，利用PTEN基因负向调控PI3K/AKT信号转导通路，能够提高p53的表达及其转录活性，提高肿瘤细胞对化疗的敏感度[17]。尽管我们已知晓PTEN在多种癌症中起关键作用，但是PTEN在MM中的作用还需进一步探索。

3.NF2基因与间皮瘤:NF2基因是一种肿瘤抑制基因，编码一个含有FERM区域的蛋白merlin，该蛋白与细胞的活动与增殖密切相关。NF2基因定位于22q12.2，由17个外显子组成。而细胞遗传学资料表明，间皮瘤细胞系中第22号染色体的数目和结构改变十分频繁。相关研究证实，40%～50%的间皮瘤患者发生了NF2的突变。由于NF2基因突变，导致其编码的蛋白质变性，从而丧失了肿瘤抑制作用[9]。

NF2编码的蛋白merlin与4.1超蛋白家族中保守的埃兹蛋白(ezrin)、根蛋白(moesin)、膜突蛋白(moesin)ERM家族具有高度同源性，EMR蛋白含有一个保守的氨基末端，称FERM区，连接着一个α螺旋臂以及一个带电荷的羧基末端区域。ERM蛋白的FERM区域与羧基尾端相互作用导致蛋白质形成一种闭合式的构象，几个蛋白结合部位被隐藏，导致ERM处于休眠状态。但不同的是merlin的羧基端缺少1个保守的F-肌动蛋白的结合位点，当merlin分子内N端和羧基端缔合时，虽处于闭合状态，但仍具有活性。若merlin的羧基端被磷酸化，抑制分子内结合，导致蛋白质具有开放状态但不具备功能上的活性。Li等[18]使用恶性间皮瘤细胞系和Met-5A永生型细胞系进行实验研究发现merlin蛋白的肿瘤抑制活性是由E3泛素化链接酶CRL4 DCAF1介导的。当merlin处于活化闭合状态，能聚集在细胞核内，并且能与DCAF1结合，抑制E3泛素化链接酶CRL4 DCAF1的生物活性，使细胞周期停止，抑制肿瘤的发生。而基质的黏附和整合素受体酪氨酸激酶信号转导的后续活化能激活丝氨酸-苏氨酸激酶PAK，使merlin的羧基端磷酸化，导致merlin失活，无法进入核内，不能抑制 CRL4 DCAF1的生物活性。CRL4 DCAF1能促进广泛的致癌基因的表达，如泛素转录因子，组蛋白，染色质重塑酶等，导致肿瘤的产生。而Marrow等[19]发现merlin失活不仅仅是基突变导致的，其他机制也能使merlin失活。McClatchey等发现Merlin通过对细胞表面多种受体的调控来抑制信号转导，而一旦Merlin失活，就会激活多种促有丝分裂的信号通道，导致细胞异常增殖。其中研究较多的是PI3K-AKT-mTOR通路。哺乳动物西罗莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，被认为是一种雷帕霉素的细胞内靶点。细胞外信号分子作用于受体酪氨酸激酶，激活K-ras和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)，后者可使蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)激活，而活化的AKT可直接激活mTOR，也可通过下游信号作用于mTOR。该通路不仅在蛋白合成与细胞增殖中起重要调节作用，与肿瘤的侵袭转移也密切相关。研究显示，同时有PI3K和mTOR信号通路激活的MM患者预示更差的存活率。Lopez-Lago等研究发现merlin失活，能激活mTOR通路，促进MM细胞异常增殖。并且，在Merlin突变的MM细胞中发现，mTOR抑制剂雷帕霉素能选择性地抑制该细胞的生长。因此，mTOR蛋白可作为恶性间皮瘤潜在的治疗靶点。

Suzuki等在对21株MM细胞系进行实验时，发现其中13株细胞AKT活性增高，表明恶性间皮瘤发展过程中存在PI3K-AKT-mTOR通路的激活。通过对MPM组织和细胞系研究证实，磷酸化-mTOR的表达和NF2的表达存在反比关系。临床上利用NF2和磷酸化mTOR进行免疫组化来筛选对mTOR抑制剂敏感的MPM患者成为可能。已有研究者根据这些临床前研究，用mTOR抑制剂雷帕霉素来治疗MPM患者。此外，Brevet等研究发现，单独抑制mTOR信号通路可能不足以抑制肿瘤的生长，在MPM细胞系中，由于mTOR信号通路的抑制激活了并行c-MET，表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)和胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)信号通路，可能进一步激活AKT。随后Carracedo等研究发现，单独抑制mTOR信号通路减轻了PI3K的反馈抑制，从而允许恢复PI3K的下游AKT信号激活。为了解决mTOR反馈激活AKT这一问题，双PI3K/mTOR抑制剂已被广泛应用于临床。

三、展 望

大量研究表明，石棉暴露与恶性间皮瘤的发生、发展密切相关，恶性间皮瘤的诊断可直接归属于职业的石棉暴露。西方国家已经禁止石棉的生产及销售，而我国大部分地区仍在继续使用。随着恶性间皮瘤发生率的不断上升，对其建立强制的预防、诊断及治疗措施是必不可少的。同时，随着对MM细胞遗传学及表观遗传学的研究发现，许多抑癌基因的突变、缺失会直接影响恶性间皮瘤的发生、发展，在其诊断、治疗及预后中具有潜在的生物标志物作用。虽然近年来对恶性间皮瘤分子生物学特别是某些抑癌基因及其蛋白功能的研究取得重大的进展，但仍存在许多疑问，如恶性间皮瘤的发病机制尚未完全阐述;间皮瘤的潜伏期很长，它的转化过程中是否涉及多个基因的协同作用。此外，NF2基因的失活及PTEN基因表达的下调都能活化AKT基因，可见各信号通路互相交织成网，增加了对恶性间皮瘤研究的复杂性，因而有必要对参与恶性间皮瘤发生、发展的信号通路进行更加深入全面的研究，为恶性间皮瘤的个体化靶向治疗提供更多的理论依据。

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