大葱CMS 58不育系及保持系花药和花粉的显微观察

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(1北京市农林科学院蔬菜研究中心,农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室, 北京100097;2山西大学生命科学学院, 山西太原 030005)

大葱CMS 58不育系及保持系花药和花粉的显微观察

王 婵1，2赵 泓1刘倩纯1裴雁曦2*王永勤1*

(1北京市农林科学院蔬菜研究中心,农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室, 北京100097;2山西大学生命科学学院, 山西太原 030005)

利用石蜡切片技术对大葱细胞质雄性不育系 58 A1、58 A2及其保持系58 B的花药发育过程进行了比较,并利用扫描电镜技术观察了3个样品的花粉粒。石蜡切片结果显示：大葱不育系58 A1花药绒毡层提前解体,影响了正常小孢子的形成,导致花粉败育;而58 A2的花药绒毡层异常增厚,挤压药室内的小孢子,小孢子内的物质流失,导致花粉败育。58 A2药室内壁细胞细胞壁没有加厚,花药同侧的2个花粉囊之间的细胞层极厚,可能是花药成熟后无法开裂的主要原因。扫描电镜结果显示：花粉粒呈长球形或超长球形,具单沟,外壁为脑纹状雕纹,不育系的成熟花粉粒很少或多数为干瘪花粉粒。

大葱;CMS;花药;花粉;石蜡切片;扫描电镜

大葱(Allium fistulosum L.)是葱科葱属中二、三年生草本植物,广泛栽培于亚洲东部的中国、韩国和日本(Inden & Asahira, 1990),在我国最少有2 600年的栽培历史(崔连伟 等,2004),常常作为一种绿色保健蔬菜、调味品。植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)广泛存在于高等植物中, 表现为雄性器官不能形成有活力的花粉,而雌性器官的发育和植株的营养生长正常, 其遗传方式是母性遗传。目前已经在300多种植物中发现雄性不育现象(Kaul, 1988)。由于CMS可免除人工去雄的复杂操作,因此是杂种种子生产的重要途径之一,为此,许多学者将研究内容集中在植物雄性不育机理上。

高等植物的花粉粒由花粉母细胞经过减数分裂后发育形成。花粉母细胞减数分裂形成四分体,随着胼胝质壁的溶解,四分体的4个子细胞彼此分离,成为4个各含有1个细胞核的小孢子(也称作单核花粉粒)。小孢子经过分裂、生长发育为成熟的花粉粒(吴鸿和郝刚,2012)。Laser和Lesrten (1972)统计62例CMS花粉败育时期后发现双子叶植物在花粉造孢细胞至四分体时期败育较多,而单子叶植物中不育花粉败育的高峰出现在单核期至双核期;同时也有学者认为花粉败育与绒毡层及中层细胞的异常行为有关。另外对花粉超微结构的观察也揭示了植物CMS败育的机理。目前已经有学者在细胞学水平上研究了大葱不育系败育的原因。席湘媛(1991)曾指出大葱花粉败育发生在单核小孢子期的早期,王晓静等(2007)也对大葱不育机理进行了研究,总结出败育有两种类型：中层延迟解体和绒毡层提前解体;席湘媛(2000)还对大葱的花粉进行了超微结构的观察,总结出了发育过程中脂滴、各种细胞器等的变化情况。

大葱CMS 58有两个不育系58 A1和58 A2,两者败育的表型不同：前者为花药提前开裂,后者表现为花药褐化。为了探究这两个不育系的败育类型,本试验对两者及其保持系的花药进行了石蜡切片观察,且对花药和花粉进行了扫描电镜观察,以期为大葱育种中CMS 58的利用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为已经选育成的稳定遗传的大葱不育系58 A1、58 A2及保持系58 B,2012年6月种植于北京市农林科学院蔬菜研究中心试验地,于2013年开花前采集不同大小的花蕾进行显微观察。

1.2 试验方法

1.2.1 利用压片法确定花药发育时期 用醋酸洋红染色法压片观察花药,根据花粉发育的一些明显特征来确定花药发育的时期,从而确定四分体时期的花蕾大小。

1.2.2 石蜡切片的制备与观察（苏立娟，2005；Li et al.， 2006；王原媛 等，2010） 采集不同发育时期的可育及不育花蕾,在FAA固定液中固定2～24 h。不同浓度的乙醇依次脱水后,用二甲苯透明,用石蜡浸蜡及包埋,轮转式切片机切片,切片厚度为6 μm。展片与烤片之后用二甲苯脱蜡,乙醇梯度脱水,苏木精染色后用中性树胶封片, OLYMPUS显微镜观察并照相。

1.2.3 扫描电镜样品的制备与观察（曲波 等，2006） 取上述各样品的成熟花药,置于防尘处干燥,在解剖镜下将花粉撒到样品托的双面胶带上,在IB-5离子溅射仪中真空喷金镀膜,在日立s-3400N型扫描电镜下观察并拍照。每个样品测量20粒花粉的极轴长和赤道轴长,取平均值。同时,直接将各样品的成熟花药撒到样品托的双面胶带上,同样对其进行扫描电镜观察。扫描电镜在北京农业生物技术研究中心完成。

2 结果与分析

2.1 大葱花药发育时期的确定

利用普通光学显微镜,通过醋酸洋红染色法对采集到的花蕾进行花粉发育时期的观察。在对花粉发育的各个时期进行全面观察后发现,四分体时期是最容易观察和识别的时期,即使不使用任何染液,也可以很轻易地正确识别。为了提高工作效率,对处于四分体时期的30个花蕾的形态特征进行了统计。处于四分体时期的花蕾的平均长度、直径和柄长分别为(2.40±0.15) mm、(1.46±0.21) mm和(3.73±1.84 )mm。经多次反复验证,将花蕾长度作为判定小孢子发育的四分体时期较为可靠。以此长度为分界线,花蕾长度约为3.4 mm和5.4 mm时可分别收集到单核花粉粒和成熟花粉粒时期,花蕾约为2.2 mm时可收集到花粉母细胞发育的各个时期。由此,在田间通过测量花蕾的大小就可以估算出其花药发育的大致时期,为后续试验样品的采集奠定了基础。

2.2 大葱雄性不育系及其保持系花药发育过程

通过石蜡切片观察大葱保持系58 B的花药,发现每个花蕾中有6个花药,花药横切面似蝴蝶形。每个花药均由中央的一个药隔及周围的4个花粉囊组成的。4个花粉囊分为左右两半,中间由药隔相连,每个花粉囊由花粉囊壁和花粉囊室(药室)组成。在大葱6个花药外围有两轮花被,每轮3片(图1)。花粉囊壁由外至内分别由表皮、药室内壁、中层及绒毡层四部分组成。

图1大葱单个花蕾的横切图

处于减数分裂时期的花粉母细胞,细胞体积较大,核内物质浓厚,染色极深。此时期中层细胞不发达,绒毡层细胞大,细胞质浓厚,有规则地排列在小孢子母细胞的一周(图2-A)。小孢子母细胞经减数分裂后形成四分体,四分体被透明的胼胝质壁包围,此时绒毡层细胞仍整齐排列,但部分中层细胞已经开始解体(图2-B)。随后,四分体细胞外的胼胝质被绒毡层细胞分泌的胼胝质酶分解,释放出小孢子,绒毡层细胞开始解体(图2-C)。此后小孢子经双核期、三核期后发育为呈卵圆形的成熟花粉粒,同时伴随着绒毡层和中层细胞的消失。药室内壁细胞内壁纵向条纹状加厚,但在花药同侧上下2个花粉囊间的若干细胞壁并未加厚(图2-D)。当花粉粒完全成熟时,暴露在空气中的花药失水,纤维层收缩,花药由此处开裂,散出花粉粒。这就是晴天有利于花药散粉,而阴雨天时花药不容易散粉的原因。

图2大葱不育系及保持系花药发育的显微结构

不育系58 A1的花药会提前开裂,表现出不育性。对其花药发育进行观察,发现在小孢子母细胞减数分裂时期,部分绒毡层已经开始提前解体 (图2-E),四分体时期药室内侧环状的绒毡层细胞结构已经消失,药室中可以见到绒毡层细胞的断片。由于绒毡层细胞的提前解体,可以明显地观察到扁平的中层细胞(图2-F)。小孢子时期绒毡层完全消失,部分小孢子细胞胞质外流,呈透明不规则球形(图2-G)。到花粉粒成熟期,药室内成熟的花粉粒极少,药室内壁细胞细胞壁加厚,出现特有的纵向条状,花药同侧的2个花粉囊之间的细胞层较厚(图2-H)。

不育系58 A2的花药在发育过程中会褐化,表现出不育性。对其花药发育进行观察,与保持系的相比,其小孢子母细胞时期及四分体时期,组成花粉囊壁的4层细胞没有明显异常,绒毡层细胞一直保持环状结构,细胞内胞质浓厚,染色极深,与保持系没有明显差别 (图2-I、J)。但是在小孢子时期,本应开始程序性死亡的绒毡层细胞异常增厚,中层细胞略有增厚,花粉囊向内萎缩,单个药室酷似鞋状(图2-K)。中层细胞明显增厚,花粉囊继续向内萎缩,小孢子被挤压成一条染色极深的团块状物质而无法发育成花粉粒。药室内壁细胞细胞壁没有加厚,花药同侧的2个花粉囊之间的细胞层极厚(图2-L)。这种结构是58 A2的花药成熟后无法开裂的主要原因。

2.3 大葱雄性不育系及保持系花粉粒特征

大葱保持系58 B成熟花药的扫描电镜可看出许多成熟花粉粒从花药药室中散出(图3-A)。花粉粒为超长球形,赤道面观为窄椭圆形,极面观为一裂圆形,极赤比(P/E)为2.48,具有单沟,沟长达到两极(图3-B)。花粉粒外壁具有脑纹状雕饰,表面多孔穴和坑(图3-C)。

大葱不育系58 A1的成熟花药中无明显的花粉粒(图3-D)。极少数的花粉粒显示其为长球形,赤道面观为稍宽的椭圆形,极面观为一裂圆形,极赤比为1.92。具有单沟,沟较深,沟长一端达到极端,另一端终止于极端附近(图3-E)。花粉外壁的纹状及表面与保持系相似,但其上有一个明显裂口(图3-F)。

大葱不育系58 A2的成熟花药与保持系的相比,药室明显变扁,说明花粉囊萎缩内陷(图3-G)。成熟的花粉粒多为空瘪状(图3-H),呈超长球形,赤道面观为不规则形。与保持系相比,该花粉粒的单沟较深且达两极。外壁也为脑纹状,但表面的孔和穴相对较少(图3～I)。

图3大葱不育系及保持系花药及花粉扫描电镜

3 结论与讨论

3.1 石蜡切片观察花药发育

本试验通过观察不育系与保持系的花药石蜡切片,发现这两个大葱不育植株在细胞学上以不同的方式表现出败育现象,其中58 A1花药中的绒毡层,在小孢子母细胞减数分裂时期就开始提前解体,其成熟期小孢子近球形,光学显微镜下透明;而58 A2花药中绒毡层在小孢子单核期异常增厚,其成熟期小孢子极度皱缩,光学显微镜下染色极深。之前的相关研究表明了大葱的败育发生在单核小孢子时期(席湘媛,1991;王晓静 等,2007),这与本试验的结果不完全相同,这可能是由于研究对象为不同来源的雄性不育系导致的。因此,正如Laser和Lesrten(1972)报道的那样,败育可能发生在花粉发育的各个阶段,只是有些比较明显,而有些不明显从而不易观察到。

王晓静等(2007)在对大葱雄性不育系及保持系花药和花粉发育的细胞学比较研究中指出,大葱雄性不育系的小孢子有两种败育类型,第一种是绒毡层细胞正常发育,但中层细胞发生了延迟解体的现象,与逐渐缩小的药室一起挤压小孢子造成不育。第二种类型是绒毡层提前解体, 不能提供小孢子发育所需的营养, 造成小孢子的细胞质和细胞核逐渐解体, 仅剩下内空的花粉粒。谢潮添等 (2005)利用光学显微镜对大白菜雄性不育两用系的不育花药进行了观察,认为绒毡层细胞中脂类代谢的异常可能是引起花粉败育的原因,但经过电镜对超微结构进行观察,发现不育花药中绒毡层细胞的异常不是导致花粉败育的原因,而是花粉异常的结果。杨晓丽等(2008)在对芝麻核雄性不育系小孢子败育过程的超微结构观察中发现,不育小孢子外壁与可育小孢子外壁存在明显差异,尤其是缺少基粒棒。在小孢子发育成花粉粒的过程中,不育小孢子内含物集缩并逐渐减少。

在本试验中,58 A1与第二种败育类型相似, 58 A2既不属于第一种败育类型,也不属于第二种败育类型。在四分体发育成熟时,本应开始程序化死亡的绒毡层细胞没有及时解体,可能首先发生了小孢子细胞质的泄漏,绒毡层细胞吸收泄漏出来的养分而异常增厚,逐渐失去营养的小孢子核物质也逐渐解体,外形上极度皱缩。

目前报道的大多数植物雄性不育系的败育都是由于绒毡层出现异常行为。绒毡层能够合成胼胝质酶,分解四分体的胼胝质壁。绒毡层还可以形成并分泌孢粉素,参与花粉粒外壁的形成,并为小孢子发育提供营养。绒毡层细胞结构与功能异常均会引起雄性不育。而谢潮添等(2005)发现不育材料的花药在造胞细胞时期就已经表现异常。

3.2 扫描电镜观察花粉粒

通过扫描电镜观察花粉粒,本试验发现大葱不育系58 A1及保持系的花粉粒为长球形或超长球形,极面观都为一裂圆形,外壁纹状及表面的空穴相似,这些特征与杨德奎等(2009)的报道结果相一致。不育系58 A2的正常花粉粒很少或者多数为干瘪的花粉粒。两个不育系花粉粒单沟的深浅或长短有区别：不育系58 A1的单沟深且只达一极,不育系58 A2的单沟也较深。从花药外形上看,58 A2的药室变扁,这与石蜡切片花粉囊壁向内萎缩的结果相一致。

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Abstract：Comparision of anther and pollen development process between welsh onion(Allium fistulosum L.)CMS 58 A1, 58 A2and its maintainer line 58 B was conducted by using paraffin section technology. The pollen grains of these 3 samples were observed by scanning electron microscope. The results showed that the reason for welsh onion infertility might be caused by the following reasons：tapetum of 58 A1degenerated in advance leading microspore could not generate normally; while the tapetum of 58 A2thickened abnormally and squeezed the microspore leading its cytoplasm and nucleus flew away. The endothecium of 58 A2did not thicken in microspore stage, but the cell layer between 2 anthers was extremely thick. It caused the anthers could not split at maturity. The results of scanning electron microscope revealed that the pollen grain was of long ball or perprolate shape. The type of aperture was monocolpate. The ornamentation of outer wall was brain striatum. The sterile pollen was few or the majority of them were wizened.

Microscopic Observation on Anther and Pollen of Welsh Onion CMS 58 Male Sterile Line and Maintainer Line

WANG Chan1,2, ZHAO Hong1, LIU Qian-chu1, PEI Yan-xi2*, WANG Yong-qin1*

〔1Beijing Vegetable Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops (North China), Ministry of Agriculture, Beijing 100097, China ;2School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030005, Shanxi, China〕

Welsh onion; CMS; Anther; Pollen; Paraffin section; Scanning electron microscopy

王婵,硕士研究生,专业方向：蔬菜分子遗传学,E-mail：wangchanwww@163.com

*通讯作者(Corresponding authors)：裴雁曦,教授,博士生导师,专业方向：植物分子遗传学,E-mail：peiyanxi@sxu.edu.cn;王永勤,研究员,硕士生导师,专业方向：蔬菜遗传育种,E-mail：wyqty@sohu.com

2014-02-26;接受日期：2014-05-19

国家自然科学基金项目 (31372066),北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX20140111)