二维斑点追踪技术定量评价法舒地尔对糖尿病合并动脉硬化大鼠左心功能的影响

张立敏，李莎，魏红，刘楠，王盈，张子新，余陆娇，马春燕，刘爽

（中国医科大学附属第一医院1.心血管超声科；2.心内科，沈阳110001）

二维斑点追踪技术定量评价法舒地尔对糖尿病合并动脉硬化大鼠左心功能的影响

张立敏1，李莎1，魏红1，刘楠1，王盈1，张子新2，余陆娇2，马春燕1，刘爽1

（中国医科大学附属第一医院1.心血管超声科；2.心内科，沈阳110001）

目的探讨二维斑点追踪技术（2D-STE）定量评价法舒地尔对糖尿病合并动脉硬化大鼠左心结构及功能的影响。方法Wistar大鼠27只，随机分为对照组（NC组，7只）、造模组（PC组，10只）、法舒地尔组（DI组，10只）。NC组普通饲料喂养。PC组和DI组采用链脲佐菌素尾静脉注射加高脂饮食4周制备糖尿病合并动脉硬化模型，成模后分别给予生理盐水、法舒地尔4周。观测各组大鼠左室结构及心肌径向应变率（SrR）、圆周应变率（SrC）的收缩期应变率峰值（SrR-S和SrC-S）、舒张早期应变率峰值（SrR-E和SrC-E）及舒张晚期应变率峰值（SrR-A和SrC-A）。结果PC组舒张末室间隔、左室后壁厚度及舒张/收缩末左室内径均较NC组及DI组增大（P＜0.04），而NC组与DI组间差异无统计学意义（P＞0.04）。各组间短轴缩短率的差异无统计学意义（P＞0.04）。PC组心肌SrR、SrC与NC组、DI组相比明显降低（P＜0.04）；DI组SrR、SrC较NC组降低（P＜0.04），心肌病变较PC组减轻。结论2D-STE能够定量评价法舒地尔对糖尿病合并动脉硬化大鼠左室结构与功能的影响。

斑点追踪；糖尿病；动脉硬化；法舒地尔；左室功能

糖尿病是一种多代谢综合征，糖、脂代谢的紊乱促进和加重动脉粥样硬化的发生，使心血管并发症明显增多，成为糖尿病患者死亡的主要原因［1］。大量研究［2］证实内皮损伤是动脉粥样硬化形成的始动因素，Rho激酶信号通路参与了动脉粥样硬化的发生和发展，在维持血管内皮功能方面有重要作用，而糖尿病心血管疾病早期阶段存在血管内皮功能障碍［3，4］。法舒地尔作为特异性Rho激酶抑制剂，临床上已广泛用于脑血管疾病的治疗，但法舒地尔对心血管系统疾病的影响临床研究较少。本文拟通过应用二维斑点追踪技术（two dimensional speckle tracking echocardiography，2D-STE），定量评价法舒地尔对糖尿病合并动脉粥样硬化大鼠心脏功能的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及材料

1.1.1 动物：健康雄性Wistar大鼠27只，体质量200～220 g，6～8周龄，购自辽宁中医药大学动物实验中心。

1.1.2 药物及试剂：链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司），盐酸法舒地尔注射液（天津红日药业股份有限公司），高脂饲料（每40 kg配方：基础饲料78.3%，胆盐0.2%，谷氨酸钠1%，胆固醇1.4%，蛋黄粉4%，砂糖6%，花生油8%，甲基硫氧嘧啶20 g），10%水合氯醛。

1.1.3 仪器：OneTouchⅡ型血糖仪，美国BioTek多功能酶标仪，GE Vivid 7 Dimension彩色多普勒超声显像仪配有S10探头，频率4.4～9.0 MHz。Echo PAC超声工作站。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型制备：27只大鼠饲养1周后，随机分为3组，正常对照组（NC组）7只，造模组（PC组）10只、法舒地尔组（DI组）10只。NC组普通饲料喂养，另2组经尾静脉注射STZ，剂量为40 mg/kg（STZ溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液，pH4.4），同时给予维生素D3注射液以总剂量60万IU/kg分3 d灌胃。3 d后测血糖，空腹血糖＞16.4 mmol/L为糖尿病大鼠。PC组及DI组在此基础上再连续喂食高脂饮食4周，经腹主动脉超声检查有动脉粥样斑块形成，即证实为糖尿病合并动脉粥样硬化大鼠造模成功。NC组及PC组给予生理盐水，DI组给予法舒地尔10 mg·kg-1·d-1腹腔注射，用药共4周。

1.2.2 超声图像采集：实验结束时，给予大鼠10%水合氯醛溶液1 mL/kg腹腔注射麻醉，固定四肢并连接心电监护仪，剃除左前胸毛，行常规二维超声检查后，取左室乳头肌水平短轴切面3个心动周期的二维动态图像存储，帧频大于190帧/s。

1.2.3 图像数据分析：所有超声参数取3个心动周期的均值，测量舒张末室间隔厚度（interventricular septum thickness，IVST）、左室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）、左室舒张末内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd）、左室收缩末内径（left ventricular end-systolic dimension，LVESd），计算短轴缩短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）。应变参数：采用EchoPAC7.0.0工作站2D Strain软件分析左心室短轴二维图像。手动勾画心内膜边界，软件自动勾画出心外膜边界，手动调节使其与实际心内膜和心外膜边界贴合，并使感兴趣区宽度和实际心肌厚度一致。软件自动将心肌分为6节段，测量以下参数：心肌径向应变率（radial strain rate，SrR）、圆周应变率（circumferential strain rate，SrC）的收缩期应变率峰值（SrR-S和SrC-S）、舒张早期应变率峰值（SrR-E和SrC-E）及舒张晚期应变率峰值（SrR-A和SrC-A）。各指标均测量3次，取平均值，计算每个指标6节段平均值。

1.3 生化指标检测

所有动物断头法处死，采血测血糖、血脂（包括甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇）。

1.4 病理学检测

取左心室中段心肌组织，超声检测腹主动脉段，10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

PC组大鼠死亡2只，因此本研究实际检测大鼠24只，共分析心肌节段140个，剔除部分追踪不良节段，最终纳入研究的有效节段数为137个。

2.2 生化指标检测结果

PC组和DI组的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、血糖水平均明显高于NC组（P＜0.04），且DI组与PC组相比，上述指标均显著降低（P＜0.04）。PC组和DI组的高密度脂蛋白胆固醇值明显低于NC组，差异有统计学意义（P＜0.04），但DI组与PC组高密度脂蛋白胆固醇相比，虽有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.04）。见表1。

2.3 病理检测结果

病理结果（图1）显示：NC组心肌纤维排列规则，细胞核清晰，间质无充血、水肿、炎性细胞浸润（图1A）；PC组心肌纤维排列疏松、断裂，呈凝固性坏死表现，细胞核空泡状，局部心肌纤维波浪状排列，间质充血明显（图1B）；DI组心肌纤维排列较疏松，呈轻微凝固性坏死，细胞间质可见充血（图1C）。PC组主动脉病理（图2）显示内膜向内突出，内膜下可见空泡，发生广泛粥糜样改变，外膜下炎性细胞浸润，证实动脉粥样硬化造模成功。

表1 各组大鼠生化指标检测结果Tab.1 Biochemical parameter results of all groups

图1 各组大鼠心肌HE染色×40Fig.1 HE staining of mouse myocardium of three groups×40

图2 PC组大鼠主动脉HE染色×40Fig.2 HE staining of mouse aorta of PC group×40

2.4 常规超声检测结果

PC组与NC组、DI组比较，IVST、LVPWT、LVEDd、LVESd均增大，差异有统计学意义（P＜0.04），而DI组与NC组比较，差异无统计学意义（P＞0.04）；PC组的LVFS与NC组和DI组相比有降低趋势，但三者间差异均无统计学意义（P＞0.04）。见表2。

2.5 心肌径向及圆周应变率

PC组大鼠左室SrR-S、SrR-E、SrR-A、SrC-S、SrC-E、SrC-A较NC组及DI组明显减低（P＜0.04），DI组各数值较NC组减低（P＜0.04）。见表3及图3。

3 讨论

糖尿病患者心血管事件发生率是非糖尿病患者的4～4倍，一般认为与机体代谢紊乱引起的心肌损伤有关，有学者［4］提出了“糖尿病是糖脂病”的概念，临床上以早期舒张功减低为特征。研究发现左心室重构是糖尿病心肌损伤发生的结构基础［6］，是导致糖尿病患者发生心衰和致死的重要原因。本研究显示糖尿病合并动脉硬化大鼠左室心肌肥厚，重构明显。

Rho/ROCK激酶信号通路参与多种细胞功能，如细胞凋亡、分化与迁移、细胞骨架重构、平滑肌收缩、应力纤维的形成等，在糖尿病心血管病变及动脉硬化中起着重要作用［7，8］。法舒地尔通过抑制Rho激酶，可以拮抗炎性反应，减轻组织损伤，同时增加内皮细胞一氧化氮合酶的表达，对组织损伤具有保护作用。同时可以抑制钙敏化效应，扩张血管［9］。许多研究［10］均发现法舒地尔能改善动脉粥样硬化患者的内皮功能，减少动脉斑块，并且该作用与法舒地尔对Rho激酶抑制的程度相关［11］。本研究发现，DI组大鼠心肌厚度、心室内径较PC组大鼠明显减小，心肌功能较PC组明显改善，间接证明法舒地尔对Rho激酶的抑制作用。

表2 各组大鼠超声检测结果Tab.2 Testing results of echocardiographic parameter in all groups

表3 各组大鼠径向及圆周应变率的比较Tab.3 Results of SrR and SrC in all groups

图3 各组大鼠心肌SrC曲线Fig.3 SrC curves of three groups

左室射血分数及短轴缩短率是临床评价左心功能的常用方法，但是不能尽早反映心肌局部的功能变化。2D-STE作为超声新技术，它基于二维灰阶成像，逐帧追踪心肌组织内的斑点信号并进行分析，没有角度依赖性，可更全面、准确地评价心肌运动［12］。本研究中，虽然各组LVFS比较无明显差异，但左室SrR、SrC 3组间差异显著，与病理结果一致；同时尽管DI组左室内径、心肌厚度较NC组无明显改变，但SrR、SrC已较NC组减低，提示DI组心肌功能依然受到损害，心肌变形能力减低，这亦与病理结果一致，因而提示2D-STE能够在整体心脏收缩功能正常情况下及早发现心肌病变，定量评价局部心肌运动，较真实反映左室功能。

总之，本研究通过2D-STE技术，无创地评价了糖尿病合并动脉硬化大鼠心脏结构和功能，同时定量地检测法舒地尔对糖尿病合并动脉硬化大鼠左室结构与功能的改善，为进一步的临床应用提供有效的信息。

［1］Xu J，Zou MH.Molecular insights and therapeutic targets for diabetic endothelial dysfunction［J］.Circulation，2009，120（13）：1266-1286.

［2］Sitia S，Tomasoni L，Atzeni F，et al.From endothelial dysfunction to atherosclerosis［J］.Autoimmun Rev，2010，9（12）：830-834.

［3］Mizuno Y，Jacob RF，Mason RP.Inflammation and the development of atherosclerosis［J］.J Atheroscler Thromb，2011，18（4）：341-348.

［4］Gojo A，Utsunomiya K，Taniguchi K，et al.The Rho-kinase inhibitor，fasudil，attenuates diabetic nephropathy in streptozotocininduced diabetic rats［J］.Eur J Pharmacol，2007，468（1-3）：242-247.

［5］McGarry JD.Banting lecture 2001：dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes［J］.Diabetes，2002，41（1）：7-18.

［6］李卫虹，李昭屏，张会欣，等.左心室壁中层缩短率评价2型糖尿病患者早期左心室收缩功能变化［J］.中国循环杂志，2011，26（6）：446-449.

［7］Kandabashi T，Shimokawa H，Miyata K，et al.Inhibition of myosin phosphatase by upregulated rho-kinase plays a key role for coronary artery spasm in a porcine model with interleukin-1beta［J］.Circulation，2000，101（11）：1319-1323.

［8］Mallat Z，Gojova A，Sauzeau V，et al.Rho-associated protein kinase contributes to early atherosclerotic lesion formation in mice［J］.Circ Res，2003，93（9）：884-888.

［9］Satoh S，Utsunomiya T，Tsurui K，et al.Pharmacological profile of hydroxy fasudil as a selective rho kinase inhibitor on ischemic brain damage［J］.Life Sci，2001，69（12）：1441-1443.

［10］Shah DI，Singh M.Involvement of Rho-kinase in experimental vascular endothelial dysfunction［J］.Mol cell Biochem，2006，283（1-2）：191-199.

［11］Wu DJ，Xu JZ，Wu YJ，et al.Effects of fasudil on early atherosclerotic plaque formation and established lesion progression in apolipoprotein E-knockout mice［J］.Atherosclerosis，2009，207（1）：68-73.

［12］Nesser HJ，Winter S.Speckle tracking in the evaluation of left ventricular dyssynchrony［J］.Echocardiography，2009，26（3）：324-336.

（编辑 陈姜）

Evaluation of the Efficacy of Fasudilon Left Ventricular Myocardial Function in Diabetic and Atherosclerotic Rats Using Two DimensionalSpeckle Tracking Echocardiography

ZHANGLi-min1，LISha1，WEIHong1，LIUNan1，WANGYing1，ZHANGZi-xin2，YU Lu-jiao2，MAChun-yan1，LIUShuang1
（1.Department of Cardiovascular Ultrasound，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Cardiology，The First Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo establish diabetic and atherosclerosis rat models，and study the effect of fasudil on left ventricular structure and function using two dimensionalspeckle tracking echocardiography（2D-STE）.MethodsA totalof27 healthy Wistarrats，6-8 weeks，were randomly divided into normal control group（NC group，n=7），positive control group（PC group，n=10），and drug intervention group（DI group，n=10）.Tail vein injection of STZ was used to prepare diabetic rats models.High-fat diets were given for 4 weeks.For the drug intervention：during the high fat feed，the DIgroup was administrated with intraperitonealinjection offasudilwith the dose of10 mg·kg-1·d-1for4 weeks.The PC group was given intraperitonealinjection ofphysiologicalsaline with the same dose.Afterconventionalechocardiography，the systolic radialstrain rate（SrR-S）and circumferential strain rate（SrC-S），early diastolic radial strain rate（SrR-E）and circumferential strain rate（SrC-E），late diastolic radial strain rate（SrR-A）and circumferential strain rate（SrC-A）were measured using 2D-STE.ResultsCompared with NC and DI groups，PC group had increased end-diastolic interventricular septum thickness，left ventricular posterior wall thickness，and left ventricular end-diastolic/systolic dimension（allP＜0.04）.No significant difference was observed between DI and NC groups（P＞0.04）.There was no significant difference found among the 3 groups in left ventricular fraction shortening（P＞0.04）.The SrR and SrC were significantly decreased in PC group compared to both NC group and DI group（P＜0.04）.The myocardial tissue was severe swollen，interstitial hyperemia and necrosis in PC group than DI group.However，SrR and SrC scores in DIgroup were stilllowercompare to NCgroup（P＜0.04）.Conclusion2D-STEcan be used forthe evaluation ofimprovementofLV function in diabetic and atherosclerotic rats thatreceived fasudiladministration.

speckle tracking echocardiography；diabetes；atherosclerosis；fasudil；left ventricular function

R440.4

A

0248-4646（2014）04-0328-04

辽宁省教育厅高校科研计划（L2010667）

张立敏（1969-），女，副教授，博士. E-mail：zhanglimin1969@126.com

2014-02-19

网络出版时间：