人参皂苷Rb1对过氧化氢诱导的B16F10鼠黑素瘤细胞凋亡的保护作用

刘海平高 华付洪军

人参皂苷Rb1对过氧化氢诱导的B16F10鼠黑素瘤细胞凋亡的保护作用

刘海平1高 华2付洪军3

目的: 确定人参皂苷Rb1对过氧化氢诱导的B16F10黑素瘤细胞凋亡的保护作用。方法:将B16F10细胞随机分为对照组，H2O2组和Rb1＋H2O2组(细胞培养液中分别加入10 mg/L、20 mg/L、50mg/L的人参皂苷Rb1和H2O2)。分别测定B16F10细胞活力、LDH漏出量、线粒体膜电位及细胞凋亡水平。结果: H2O2作用24 h后，B16F10细胞活力降低至对照组的53.77%，而Annexin V和PI阳性细胞比例为25.6%，显著高于对照组(P＜0.01)。50 mg/L人参皂苷Rb1预处理后，B16F10细胞活力为对照组的77.75%，较H2O2组增加44.6%(P＜0.01)。Annexin V和PI阳性细胞比例为14.4%，明显低于H2O2组(P＜0.01)，并且LDH漏出率明显降低，线粒体膜电位显著升高。结论: 人参皂苷Rb1对H2O2所致的B16F10黑素瘤细胞凋亡具有保护作用，有效提高其抗氧化应激能力。

人参皂苷Rb1； B16F10细胞； 凋亡

白癜风是一种获得性、进行性色素脱失性疾病，其发病机制尚未完全阐明，但越来越多的证据表明，氧化应激可能是白癜风黑素细胞缺失的重要原因。过氧化氢(H2O2)是机体氧化代谢的产物，也是一类活性氧自由基(ROS)。1Schallreuter等2研究发现，进展期白癜风患者表皮内H2O2水平升高。体外研究也表明，H2O2能使黑素细胞树突回缩，形态改变，抑制黑素细胞增殖和色素合成，故推测H2O2为主的氧化剂在黑素细胞环节对白癜风的发病起重要作用。3人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)内含有能够清除自由基的抗氧化物质，不仅可以直接清除氧自由基，也可以通过增强胞浆内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－PX)及过氧化氢酶(CAT)的活性间接清除氧自由基。4本实验以H2O2损伤B16F10鼠黑素瘤细胞造成氧化应激损伤模型，观察人参皂苷Rb1对黑素瘤细胞的保护作用，并从细胞活力和细胞凋亡等方面阐明其作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司，人参皂苷Rb1购于南京广润生物制品有限公司，四氮唑蓝(MTT)和线粒体膜电位检测试剂盒(JC－1)购自Sigma公司，乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。Annexin V＆PI凋亡检测试剂盒购自Calbiochem公司。B16F10鼠黑素瘤细胞购自中科院上海细胞库。

1.2 实验分组 常规培养的B16F10细胞随机分组:①对照组，细胞培养液不加任何处理因素，37℃培养24 h；②H2O2组，细胞培养液中加入终浓度为100μM的H2O2，37℃培养24 h；③Rb1＋H2O2组，将培养的B16F10细胞中分别加入10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的人参皂苷Rb1预处理6 h后，细胞培养液中加入终浓度100μM的H2O2，37℃培养24 h。

1.3 检测及方法

1.3.1 MTT法测定B16F10细胞活力 各组细胞接种于96孔板，细胞密度为1×104cells/孔，每组8孔，每孔加MTT溶液10μL(5 g/L)，37℃孵育4 h；弃上清，每孔加入100μL DMSO，振荡10 min，使结晶物完全溶解。于波长570 nm处测各孔吸光度(A)值，各组细胞活力以占对照组百分比表示。

1.3.2 LDH漏出量测定 收集各组细胞，离心、取上清，按说明书以分光光度计比色法测定细胞培养上清LDH漏出量。

1.3.3 JC－1线粒体功能检测 收集各组细胞(2× 105cells/组)，用预温(37℃)的完全培养基调整至1 mL。细胞悬液加入JC－1储存液(1 mg/mL)2.5μL，振荡细胞悬液直至标本形成均一的红紫色；37℃避光保存10 min。加入2 m L PBS至细胞悬液中，2000 r/ min室温离心5 min，去上清；以0.3 mL PBS重悬细胞，流式细胞仪分析。用发红色荧光细胞百分率(JC－1＋%)表示线粒体膜电位正常细胞的比例。

1.3.4 Annexin V＆PI法检测细胞凋亡 收集各组细胞(3×105cells/组)，用PBS洗涤2次(2000 r/min离心5 min)，弃上清；加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；细胞悬液中加入5μL Annexin V－FITC混匀后，然后加入5μL PI混匀；室温、避光、反应5～15 min，流式细胞仪检测。

1.4 统计学方法 所有实验数据采用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析，以均数±标准差表示，P＜0.05为有统计学意义。统计图采用SigmaPlot8.0软件制作。

2 结果

2.1 人参皂苷Rb1对H2O2所致B16F10细胞活力的影响 见图1。MTT结果显示:H2O2组B16F10鼠黑素瘤细胞活力为对照组细胞活力的(53.77±5.54)%，显著低于对照组(P＜0.01)；10 mg/L Rb1＋H2O2组和20 mg/L Rb1＋H2O2组细胞活力分别为对照组细胞活力的(56.74±2.96)%、(61.61±3.48)%，与H2O2组比较无显著差异(P＝0.255和P＝0.097)；50mg/L Rb1＋H2O2组细胞活力为对照组细胞活力的(77.75± 4.41)%，较H2O2组增加44.6%(P＜0.01)。

图1 人参皂苷Rb1对B16F10细胞活力的影响

2.2 人参皂苷Rb1对H2O2所致B16F10细胞LDH漏出量的影响 见表1。与对照组相比，H2O2组LDH漏出量明显增加(P＜0.01)；与H2O2组相比，50 mg/LRb1＋H2O2组LDH漏出量显著降低(P＜0.01)；而10mg/L Rb1＋H2O2组和20 mg/L Rb1＋H2O2组LDH漏出量无明显降低(P＝0.173和P＝0.085)。

2.3 人参皂苷Rb1对H2O2所致B16F10细胞线粒体膜电位的影响 见表1。H2O2处理后，B16F10细胞线粒体膜电位较对照组显著降低(P＜0.01)；10 mg/L和20 mg/L Rb1预处理后，线粒体膜电位与H2O2组无显著差异(P＝0.227和P＝0.075)；而50 mg/L Rb1预处理后线粒体膜电位明显升高(P＜0.01)。结果提示，50 mg/L人参皂苷Rb1具有保护线粒体，减轻H2O2对细胞线粒体的损伤。

表1 B16F10细胞LDH漏出量和线粒体膜电位(MMP)的变化

2.4 人参皂苷Rb1对H2O2致B16F10细胞凋亡的影响 见图2。流式结果显示，对照组Annexin V阳性细胞比例(4.2±1.2)%，Annexin V和PI双阳性细胞比例(8.1±1.8)%。给予H2O2处理后，凋亡水平明显增加(P＜0.01)，Annexin V阳性细胞比例(17.3±2.5)%，Annexin V和PI双阳性细胞比例(25.6±3.7)%。给予人参皂苷Rb1(50mg/L)预处理后，Annexin V阳性细胞比例(9.5±2.6)%，Annexin V和PI双阳性细胞比例(14.4±4.0)%，统计结果显示明显降低了凋亡水平(P＜0.01)。而10 mg/L和20 mg/L人参皂苷Rb1作用无统计学意义(P＝0.437和P＝0.195)。

图2 人参皂苷Rb1对H2O2致B16F10细胞凋亡的影响

3 讨论

H2O2是一种活性氧自由基(ROS)，能自由穿过细胞膜、核膜与金属离子反应，产生羟自由基，羟自由基可以与嘌呤和嘧啶发生反应，损伤细胞DNA。5，6ROS还能作为细胞内信使激活转录因子，通过影响基因转录，促使凋亡基因上调，诱导细胞发生凋亡。7目前研究表明，低浓度(小于100μM)H2O2主要导致细胞凋亡，高浓度H2O2主要导致细胞坏死。8本研究结果表明，B16F10黑素瘤细胞在H2O2作用下细胞活力和线粒体膜电位均下降，培养上清中LDH漏出量及细胞凋亡率增加，说明H2O2可通过诱导氧化应激引起黑素瘤细胞的凋亡。

由于氧化应激在白癜风发病机制中的重要作用，抗氧化剂在白癜风治疗中的作用逐渐引起重视。9Jeong等10研究发现槲皮素和绿茶提取物具有较强的抗氧化作用，可以抵抗氧化应急对细胞的损伤，对H2O2诱导的Mel－Ab细胞损伤具有保护作用。Rojas等11研究发现，外用抗氧化剂及线粒体刺激剂联合口服抗氧化剂及苯丙氨酸治疗稳定型白癜风疗效最好。作者分析该疗法可能是通过纠正ROS造成的细胞和线粒体损伤使黑素细胞功能得到恢复。本实验使用的人参皂苷Rb1是近年来研究较多的一类人参单体，具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力和增强记忆力等功效。4，12

50 mg/L人参皂苷Rb1预处理后H2O2所致B16F10黑素瘤细胞活力降低明显受到抑制，减少了细胞凋亡的发生，这说明人参皂苷Rb1对氧化应激损伤致B16F10细胞凋亡具有保护作用。此外，实验结果还显示，50 mg/L人参皂苷Rb1能够有效地减少细胞内LDH漏出量，部分恢复细胞线粒体膜电位水平。近年来研究发现，线粒体除了具有细胞能量转换的功能，还是参与细胞凋亡的重要细胞器，线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。本研究结果提示，人参皂苷Rb1抗细胞凋亡的作用与减少细胞内ROS过氧化损伤和保护线粒体功能有关。

人参具有保护机体细胞免受应激损伤的作用。本研究观察用人参的有效成分人参皂苷Rb1可以有效提高黑素瘤细胞抗氧化应激的作用，为临床应用人参提取物治疗白癜风提供了实验依据。

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(收稿:2013－09－03 修回:2013－12－07)

Protective effects of ginsenoside Rb1 on B16F10 cells apoptosis induced by H2O2

LIU Hai-ping，GAO Hua，FU Hong-jun.Department of Dermatology，Beijing Tieying Hospital，Beijing，100078

Objective:To determine the protective effects of ginsenoside Rb1 on B16F10 cells apoptosis induced by H2O2.Methods:B16F10 cellswere random ly divided into blank control group，H2O2group and Rb1＋H2O2group.In the Rb1＋H2O2group B16F10 cells were cultured with ginsenoside Rb1(in three doses of 10mg/L，20mg/L and 50mg/L)before treated with H2O2.The viability of B16F10 cellswas calculated by MTT assay.The outleakage of lactate dehydrogenase(LDH)，mitochondrialmembrane potential and the level of apoptosisweremeasured accordingly.Results:After treated with H2O2for 24h，the viability of B16F10 cells decreased to 53.77%of the control group，while the proportion of Annexin V＆PIpositive cells significantly increased to 25.6%of the control group(P＜0.01).When pre－treated with 50mg/LRb1，the cell viability increased to 77.75%of the control group，which was 44.6%higher than that of the H2O2group(P＜0.01).The proportion of Annexin V＆PI positive cells significantly decreased to 14.4%compared with H2O2group(P＜0.01).Meanwhile ginsenoside Rb1(50mg/L)significantly decreased LDH outleakage and inhibited the decrease ofmitochondrialmembrane potential.Conclusion:Ginsenoside Rb1 can protect the B16F10 cells against H2O2－induced apoptosis and effectively improve the ability of antioxidative stress.

ginsenoside Rb1；B16F10 cells；apoptosis

1北京丰台区铁营医院皮肤科，北京，100078

2首都医科大学附属北京天坛医院，北京，100050

3山东济宁市第一人民医院，济宁，272011