多柔比星对新西兰大白兔心功能及心肌血管紧张素Ⅱ水平的影响

张 辉，郑荣琴，钱孝贤，郝宝顺，张成喜

(中山大学附属第三医院1.超声科，中山大学超声与介入治疗研究所，2.心内科，广东广州 510630)

多柔比星对新西兰大白兔心功能及心肌血管紧张素Ⅱ水平的影响

张 辉1，郑荣琴1，钱孝贤2，郝宝顺2，张成喜2

(中山大学附属第三医院1.超声科，中山大学超声与介入治疗研究所，2.心内科，广东广州 510630)

目的 研究多柔比星对兔的心肌毒性作用及其机制。方法 雄性健康新西兰大白兔静脉注射多柔比星2 mg·kg－1,每周1次,连续8周,分别于给药前、给药期间及停药后8周内每隔7 d采用超声检测射血分数和心导管检测左心室压力最大上升速率(＋dp/dtmax),HE染色及透射电镜观察心肌组织形态及心肌细胞超微结构,TUNEL法测定凋亡指数,Western蛋白质印迹法测定血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平。结果给药7次后,射血分数明显下降(P＜0.05),8次后下降至谷底；给药3次后,＋dp/dtmax明显降低(P＜0.05), 8次后的第1周时达到最低,之后逐步上升,停药后第6周不再出现明显上升,但未恢复至正常水平。给药2次后,心肌AngⅡ水平明显增加(P＜0.05),停药后的第1周最高,之后逐步下降,停药后第6周不再出现明显降低,但是未降低至给药前的水平。给药1次心肌凋亡指数明显增加(P＜0.05),停药后的第1周达到高峰,之后逐步下降,停药后第5周末不再出现明显降低,但是数值仍然高于给药前。结论 多柔比星毒性可导致兔心肌AngⅡ水平升高,继而可通过活性氧和钙离子失衡诱导心肌结构进一步破坏和心室重构。

血管紧张素；多柔比星；心脏毒性

蒽环类药物是目前比较常用和有效的抗肿瘤药物，广泛用于多种肿瘤的治疗。但是蒽环类药物可能导致心脏毒性反应，严重时可以造成充血性心力衰竭，严重影响了蒽环类药物临床应用[1]。目前国内外学者对于蒽环类药物的心脏毒性的研究认为，蒽环类药物及蒽环药物-离子复合物通过氧化应激作用促进活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成，而且蒽环类药物也可以与心肌细胞内Fe3＋结合，产生螯合物，刺激ROS的生成，同时心脏组织中抗氧化物质减少。ROS一方面通过膜脂质过氧化破坏细胞膜和线粒体膜，导致心肌细胞损伤，诱导心脏线粒体病以及慢性心肌病的线粒体和呼吸链的损伤。另一方面使得细胞和线粒体内外钙离子的平衡受到破坏，影响重要蛋白的表达，损伤线粒体DNA，阻止线粒体提供生物能量，降解肌丝，破坏心肌运动的物质基础，最终导致细胞凋亡[2－5]。蒽环类药物的心脏毒性反应分为急性、亚急性、早期慢性和迟发性4个类型[6]。其中早期慢性心脏毒性反应出现在给药后稍晚或数周到数月内，病变类似于扩张型心肌病的表现，随之出现左心室收缩功能紊乱和充血性心衰，且具有独特的病理学改变，包括肌浆网扩张、细胞浆空泡形成、线粒体肿胀和肌丝排列紊乱和消失。

本研究通过给兔静脉注射多柔比星，造成心脏毒性反应，超声检测给药前后心功能，Western蛋白质印迹法检测心肌中血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)水平的变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

盐酸多柔比星粉剂(每瓶10 mg，汕头经济特区明治医药有限公司生产，批号:080602)，以生理盐水稀释成1 g·L－1。戊巴比妥钠粉剂(广州市威佳科技有限公司提供，批号57-33-0)。SSD-α10数字超声诊断仪，日本Hitachi-Aloka公司；5130高频探头，探头频率5～13 MHz。

1.2 实验动物及处理

100只雄性健康新西兰大白兔用于预实验及正式实验〔广东省实验动物中心提供，动物质量合格证号:0046418，动物实验设施使用许可证号:SYXK (粤)2007-0081〕，约4月龄，体质量2～2.5 kg。所有实验兔置于中山大学实验动物中心饲养标准单笼饲养，按需给予饲料。实验过程中因死亡而补充兔19只，死亡原因包括厌食、腹泻、心衰、严重心律失常、麻醉意外及术中心包填塞。

实验兔用兔固定器固定，耳缘静脉注射多柔比星溶液，参照文献[7]每次注射2 mg·kg－1，每周1次，共8周，总量约相当于16 mg·kg－1。给药8周后停药，继续观察8周，总实验时间16周，分别于给药前、给药期间每间隔7 d及停药后的连续8周内，依次各随机取4只兔，共17个时间点，按指标进行检测。

1.3超声测定射血分数

每周末随机选择4只兔作为检查对象，超声检测前从兔耳缘静脉缓慢注射3%戊巴比妥钠1 mL·kg－1麻醉，连接超声仪心电生理线于兔四肢，通过双平面Simpson法测定射血分数。

1.4心导管测定左心室压力最大上升速率

完成射血分数检查的兔，颈部备皮后使用硬膜外麻醉管连接多导电生理检查仪，管内充满0.4%肝素氯化钠溶液，分离兔右侧颈总动脉，通过右颈动脉插管，测定颈总动脉内血压，然后继续进管，通过主动脉瓣口进入左心室，测定左心室压力最大上升速率 (maximalrate ofrise ofleftventricular pressure，＋dp/dtmax)。

1.5心肌样本的制备

完成超声和心导管检查的4只兔耳缘静脉静推注空气处死。开胸剥离心包，得到离体心脏，放入10%甲醛溶液中固定，48 h后取材。

1.6 HE染色及透射电镜观察心肌组织形态和心肌细胞超微结构

取1.5制备的心肌样本，常规HE染色，光镜检查摄片，观察心肌和颈动脉病理改变。心肌样本2.5%戊二醛中固定，透射电镜(transmission electron microscope，TEM)观察心肌细胞肌原纤维的肌小节、线粒体、肌浆网和心肌细胞核结构。观察颈动脉内皮细胞形态结构、平滑肌细胞、弹力纤维形态和排列情况。

1.7 TUNEL法检测心肌细胞凋亡

取1.5制备的心肌样本，TUNEL法检测心肌细胞凋亡。在光镜400倍视野下，每张切片随机拍摄10个矩形的阳性视野，每个视野计数100个细胞核，根据阳性细胞所占的百分比作为凋亡指数(apoptosis index，AI)，AI(%)＝凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.8 Western蛋白质印迹法检测心肌AngⅡ水平

使用武汉博士德公司兔抗AngⅡ多克隆抗体作为一抗，HRP标记羊抗兔IgG抗体作为二抗，选择GAPDH作为内参对照，将1.5获得的部分离体心脏标本置于－196℃液氮中急冻，保存于－70℃低温冰箱中用于分析。按照标准Western蛋白质印迹法检测步骤进行蛋白质样品制备，蛋白质含量的测定，SDS-PAGE电泳，转膜，免疫反应，化学发光、显影和定影、凝胶图像分析。以目标条带的积分吸光度值(integrated absorbance，IA)与内标蛋白的IA比值表示待测蛋白的相对表达水平。

1.9统计学分析

2 结果

2.1多柔比星对新西兰大白兔心脏射血分数和左心室压力最大上升速率的影响

表1结果显示，与给药前相比，给药7次后(第7周起)，射血分数明显减低(P＜0.05)；给药8次后，射血分数值下降至谷底。停药后射血分数小幅上升并呈波动趋势，但始终低于给药前，且与给药8次时相比无统计学差异。

与给药前相比，给药3次后(第3周起)＋dp/dtmax明显降低(P＜0.05)，停药1周(第9周)时达到最小，之后的＋dp/dtmax数值呈缓慢上升趋势，停药6周时达较高水平，与停药1周比较，具有统计学差异。停药7周和8周后，＋dp/dtmax数值与6周比较无统计学差异(表1)。

2.2多柔比星对新西兰大白兔心脏组织结构的影响

光镜结果显示，给药前心肌细胞结构正常(图1A)；给药后第1周心肌细胞程度不等的退行性变(照片略)；第8周时心肌细胞广泛空泡变性，肌原纤维溶解，灶性心肌坏死，部分心肌细胞核固缩、变形，组织间质严重水肿，间质纤维组织增多，少量炎性细胞浸润(图1B)；停药后心肌细胞空泡变性和组织间质水肿减轻(照片略)。

电镜结果显示，给药前心肌细胞超微结构正常(图1C)；给药第1次心肌细胞线粒体肿胀，嵴断裂或消失(图1D)，继续给药除了可见线粒体肿胀和嵴断裂外，还可见肌浆网扩张。肌丝排列紊乱或消失，肌节长短不一，出现异常收缩带，可见凋亡细胞，间充质细胞和纤维增生(图1E)；给药第8周时上述病变范围更加广泛呈弥漫分布(图1F)，停药4周时上述病变范围仍然较为广泛(图1G)；停药7周后上述病变有所减轻，范围缩小(图1H)。

Tab.1 Effect of doxorubicin on eject fraction(EF) and maximal rate of rise of left ventricular pressure (＋dp/dtmax)of rabbits

Fig.1 Effect of doxorubicin on New Zealand white rabbit cardiac structure under light microscope(A，B) and transmission electron microscope(C，D，E，F，G，H).A:before administration；B:doxorubicin 2 mg·kg－1×8；C: before administration；D:doxorubicin 2 mg·kg－1×1；E:doxorubicin 2 mg·kg－1×4；F:doxorubicin 2 mg·kg－1×8；G:4 weeks after administration；H:7 weeks after administration.Arrows show cristae of mitochondria，mitochondrial swelling and cristae，abnormal contraction bands.

Tab.2 Effect of doxorubicin on apoptosis index(Al) in myocardium of rabbits

2.3 多柔比星对新西兰大白兔心肌细胞凋亡的作用

表2结果显示，心肌AI在第1次给药后(第1周)明显增加，与给药前相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。之后AI呈现逐步上升趋势。AI在停药后1周达到高峰，之后AI呈现下降趋势，停药后5周达到较低水平，与停药后1周比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。停药后6～8周与停药后5周相比均无统计学差异。

2.4 多柔比星对新西兰大白兔心肌组织内血管紧张素Ⅱ水平的影响

Western蛋白质印迹(图2A)及其半定量结果(图2B)显示，给药后心肌组织内AngⅡ表达呈逐步上升趋势。从图2B可见，给药2次后(第2周)AngⅡ表达与给药前相比有统计学差异(1.61±0.46 vs 0.66± 0.23，P＜0.05)；在停药1周时，AngⅡ达到最高，然后呈现逐步下降趋势；停药后6周达较低水平，与停药后1周相比有统计学差异(0.91±0.35 vs 4.20± 0.41，P＜0.05)；停药后7～8周与停药后6周相比无统计学差异，说明停药后的恢复程度有限。

Fig.2 Effect of doxorubicin on angiotensinⅡ(AngⅡ) level in myocardium of rabbits by Western blotting. See Tab.1 for the treatment.A:Western blot result.B:the semiquantitative result of A.1:before administration；2:doxorubicin 2 mg·kg－1×1；3:doxorubicin 2 mg·kg－1×2；4:doxorubicin 2 mg·kg－1×3；5:doxorubicin 2 mg·kg－1×4；6:doxorubicin 2 mg·kg－1×5；7:doxorubicin 2 mg·kg－1×6；8:doxorubicin 2 mg·kg－1×7；9:doxorubicin 2 mg·kg－1×8；10－17:one to eight weeks after administration，respectively.，n＝4.∗P＜0.05，compared with before administration；＃P＜0.05，compared with one week after administration.

3 讨论

本研究发现，在正常兔心肌组织中，存在较低水平的AngⅡ表达，当静脉给予多柔比星后，早期可以检测到心肌AngⅡ水平增加，推断是AngⅡ的介导氧化应激等作用以及心脏代偿机制开始发动，心肌组织内AngⅡ含量呈现上升趋势。以往研究认为，AngⅡ在心肌组织中的水平升高是心室重构的特征之一，升高的原因包括水钠潴留、增加左心室舒张末期容积导致心肌受到的牵张力增大和醛固酮的增加[8－10]。第8周最后1次给药后，心肌损害仍然有所进展，因此，在第9周兔的心肌内AngⅡ水平明显上升达到高峰。以往研究认为，AngⅡ可以激活NADPH氧化酶复合体，由此可以引起ROS的增加，这时伴随心肌氧自由基清除能力下降。因此AngⅡ可以通过ROS途径诱导和促进心室重塑，同时细胞内外的钙离子平衡破坏可以导致细胞结构损害[11－16]。随着停药时间的逐步延长，心脏功能部分好转，心肌组织内的AngⅡ的水平呈逐步下降趋势。停药后，心肌毒性损害逐渐减弱，ROS含量减少及钙离子失衡好转，从而心肌结构得到部分修复，细胞病变有所减轻，凋亡的心肌细胞所占的比例逐步减少，随着心肌组织修复、纤维组织增生，左心室收缩功能逐步得到一定程度的恢复。以往研究也发现，在心肌受损后部分固有心肌细胞能够重返细胞分裂周期，通过低强度分化复制从而发挥修复代偿作用[17]。有研究表明，AngⅡ受体抑制剂可以改善心力衰竭，预防和逆转心室重塑[18－19]。

综上所述，多柔比星可导致兔心肌AngⅡ水平升高，升高的AngⅡ可能通过ROS和钙离子失衡诱导心肌结构的进一步破坏和心室重构。

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(本文编辑:乔 虹)

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Effects of doxorubicin on changes of cardiac function and angiotensinⅡlevel in myocardium of New Zealand white rabbits

ZHANG Hui1，ZHENG Rong-qin1，QIAN Xiao-xian2，HAO Bao-shun2，ZHANG Cheng-xi2
(1.Department of Ultrasound，the 3rd Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Institute of Diagnostic and Interventional Ultrasound，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China；2.Cardiovascular Department，the 3rd Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China)

OBJECTlVE To investigate the myocardial toxicity of doxorubicin on the myocardium of rabbits and mechanism.METHODS Doxorubicin 2 mg·kg－1was injected once a week for eight weeks. After discontinuation of doxorubicin，observation was performed for another 8 weeks.Every weekend，ultrasound examination，cardiac catheterization，angiotensinⅡ(AngⅡ)Western blotting and pathological examination were performed to analyze eject fraction(EF)，maximal rate of rise of left ventricular pressure(＋dp/dtmax)，AngⅡexpression level，apoptosis index(AI)and the structure of the myocardium. RESULTS At the 7th injection，EF decreased(P＜0.05)，but reached the bottom value at the 8th injection.At the 3rd injection，left ventricular＋dp/dtmaxdecreased(P＜0.05)and reached the bottom value one week after withdrawal.After that，it increased and reached a high value six weeks after withdrowal.But it was still lower than before administration.At the 2nd injection，AngⅡexpression increased (P＜0.05).At 1 week after withdrawal，it reached the top value，but than decreased and reached a low value six weeks after withdrowal，but was still higher than before administration.At the 1st injection，AI increased(P＜0.05).At 1 week after withdrawal，it reached the top value，but then decreased and reached a low value 5 weeks after withdrawal.But it was still higher than before administration. CONCLUSlON Doxorubicin cardiac toxicity can induce an elevated level of myocardial AngⅡ，possibly associated with increased aldosterone and myocardial tension.Increased AngⅡ may induce further myocardial structural damage and ventricular remodeling through the ROS and calcium imbalance.

angiotensin；doxorubicin；cardiac toxicity

ZHENG Rong-qin，E-mail:zhengrongqin123＠163.com

R979.1

A

1000-3002(2014)04-0497-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.04.004

Foundation item: The projectsupported by Guangdong ProvincialScience ＆ Technology Foundation (2011B061300005)

2013-05-10 接受日期:2013-12-25)

广东省科技计划基金资助项目(2011B061300005)

张 辉(1974－)男，博士，主要从事心血管疾病研究；郑荣琴(1964－)，女，教授，主要从事超声诊断与介入治疗研究。

郑荣琴，E-mail:zhengrongqin123＠163.com