胶体金免疫层析技术应用研究进展

樊淑华，王永立

（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口466001）

胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）是以胶体金做为示踪物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。自1971年Faulk W P和Taylor G M［1］首次创立胶体金免疫层析技术在大肠埃希菌应用以来，该技术已成为继荧光标记、酶标记和放射性免疫标记之后的又一种新型的免疫标记技术。本文综述了近4年来胶体金免疫层析技术在动物疾病检测、毒物及药物残留、重金属离子监测等方面的最新研究进展。

1 胶体金免疫层析技术在疾病监测中的应用

在应用胶体金免疫层析技术检测动物病毒中基本都采用双抗体夹心法。该方法多用胶体金标记单克隆抗体作为捕捉抗体（capture antibody，cAb），可与样品中的抗原特异性结合；将另一株单克隆抗体（或多抗）包被检测线作为检测抗体（detection antibody，dAb），用抗标记单克隆抗体的多抗包被质控线作为质控抗体（control antibody）以检测试纸条的有效性。当待检样本中含有检测抗原时，在检测区和质控区出现两条肉眼可见的红色条带，反之则仅在质控区出现一条红色条带。该技术广泛应用于动物病毒性疫病、动物细菌性疾病及人畜共患病的监测中。

1.1 胶体金免疫层析技术在病毒性疾病监测中的应用

胶体金免疫层析技术在动物病毒性疾病，特别是在猪圆环病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等病毒的检测中应用广泛。如Jin Q 等［2］采用重组核衣壳蛋白作为检测抗原建立了检测猪圆环病毒2型（PCV-2）的胶体金免疫层析方法，并采用该方法和商品化ELISA 试剂盒分别对500 份临床血清样品进行检测，其符合率为94%。表明该方法具有良好的特异性和敏感性。Jiang T 等［3］以豚鼠抗口蹄疫病毒（FMDV）的多抗作为捕捉抗体，以兔抗FMDV 的多抗为检测抗体，羊抗豚鼠的二抗作为质控抗体建立了检测FMDV A 亚型的双抗体夹心免疫层析方法，该方法与其他亚型FMDV、猪水疱病病毒、猪水疱性口炎病毒之间均无交叉反应，其检测极限为11.7ng／mL。临床检测结果表明，该方法与双抗体夹心ELISA 方法具有一致的敏感性和特异性，且操作简单快速，15min内能够得出检测结果，是一种适合于临床检查的快速诊断方法。Li X 等［4］在大肠埃希菌BL21中表达猪瘟病毒（CSFV）E0 和E2 蛋白主要抗原域，以纯化的嵌合蛋白（CnC2）为抗原建立了快速检测猪瘟血清中CSFV 疫苗抗体滴度的免疫胶体金试纸条。该研究以嵌合蛋白作为捕捉抗原，以SPA 和抗CnC2 的单克隆抗体分别包被检测线和质控线，研制的试纸条与商业化的ELISA 试剂盒的检测符合率为93.5%，敏感性和特异性分别为97.0% （65／67）、100% （98／98），特别适合于猪瘟抗体滴度的大范围临床监测。除采用病毒蛋白作为检测抗原外，Yang S等［5］还发明了一种基于合成肽技术的免疫胶体金试纸条，该研究从FMDV 非结构蛋白中筛选了一条能够与FMDV 感染猪血清发生阳性反应，而不能与疫苗接种猪血清发生反应的多肽，并以该多肽作为检测抗原，研制出能够区别O型口蹄疫病毒感染猪与疫苗免疫猪的胶体金试纸条，该试纸条与商业化Ceditest（R）ELISA 和UBI（R）ELISA 试剂盒的符合率分别为98.59% 、96.63%，并具有良好的特异性和敏感性。另外，胶体金免疫层析技术在其他动物病毒性疾病如鱼类疾病的检测中也应用广泛，如Sheng X Z 等［6］研制了检测鱼淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus，LCDV）快速检测试纸条，该研究采用抗LCDV 的两种单克隆抗体2D11和1A8分别作为捕捉抗体和检测抗体，以羊抗鼠的二抗为质控抗体组装试纸条，与商业化试纸条和点印迹法的平行检测证明该方法具有很高的特异性和敏感性，极限检测值为1 μg／mL，室温下可保存6个月，4 ℃能保存12个月，具有较高的稳定性。

近年来，人畜共患病频发，危害日趋严重，如不同亚型的禽流感病毒引发的高死亡率及存在人与人之间传染的潜在可能性，使这些病原的快速、特异的检测方法的建立成为迫切需要。而胶体金免疫层析技术不仅具有较强的特异性，而且检测迅速，不需要特殊的仪器设备，特别适用于疾病现场的大规模检测。如Miyoshi Akiyama T 等［7］以抗H1N1亚型流感病毒NP蛋白的单克隆抗体为捕捉抗体，建立了特异性检测2009年H1N1亚型大流感（AH1pdm）的胶体金试纸条。试验表明，该试纸条能够特异性检测AH1pdm，且不与季节性H1N1、H3N2 亚型和B型流感病毒发生交叉反应，具有较强的特异性；采用该方法和PCR 方法平行对临床分离的5份人AH1pdm 样品进行检测，两种方法检测结果一致且都为阳性，说明该试纸条具有较强的敏感性。Kang K等［8］采用抗血凝素（HA）的特异单克隆抗体建立了检测2013年H7N9亚型禽流感的免疫层析方法。该方法检测 H7N9 流感病毒的最低检测极限为103TCID50，能够从重组HA 抗原中特异检测H7亚型，包括H7N9和H7N7亚型病毒，不会与其他亚型如H1N1、H3N2、H5N1、H5N9和H9N1亚型发生交叉反应。对病人（RT-PCR 方法确诊）的检测敏感性为59.4%（19／32），对阳性唾液样品的检测敏感性为61.5%（16／26），对180份阴性样品的检测中未出现假阳性，说明该方法具有较好的特异性。这些免疫层析方法的建立对于流感的防控起到了积极的预防作用。

1.2 胶体金免疫层析技术在细菌性疾病监测中的应用

胶体金免疫层析技术也广泛应用于动物细菌性疾病的检测中，如用于猪链球菌、兔土拉杆菌等病原的检测。Ju Y 等［9］研制了出检测猪2 型链球菌的胶体金试纸条，该方法的检测敏感度高达106CFU／mL，与其他血清型的链球菌（除SS1／2型以外，因SS1／2与2型链球菌具有相同的抗原决定簇）无交叉反应。Kilic S等［10］研制出检测野兔热土拉杆菌的胶体金试纸条，与微量凝集试验结果相比，该方法的敏感性和特异性分别为99.3% 和94.6%。该方法在检测正常血清样品，自身免疫性疾病及细菌、病毒和寄生虫感染的血清学样品时均无交叉反应。Moongkarndi P等［11］建立了快速检测鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的的胶体金方法，该研究分别使用了抗鼠伤寒和抗肠炎沙门菌两种单克隆抗体，与特异性识别鼠伤寒的单克隆抗体组装成了双夹心的试纸条。该试纸条能够快速检测培养基中的鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌，检测极限分别为104和106CFU／mL。临床检测结果表明，该方法检测鼠伤寒和肠炎沙门菌的敏感性分别为98.89% （89／90）和87.50% （70／80）。与商业化的检测方法相比，该试纸条的特异性为100%，且该试纸条是首个同时检测两种不同的沙门菌的胶体金方法，为养鸡场和其他肉制品的大批量检测提供了一种简单、快速的检测手段。Shukla S 等［12］建立了一种基于脂质体的免疫胶体金方法，该方法使用荧光染料磺酰罗丹明B标记免疫脂质体（脂质体与亲和纯化的羊抗沙门菌IgG 的多克隆抗体），分别将羊抗沙门菌IgG 的多克隆抗体和兔抗羊的IgG 作为检测抗体和质控抗体，结果表明，该方法的检测极限为102CFU／mL，远远高于商业化试纸条的检测极限（107CFU／mL）。另外，胶体金免疫层析技术在细菌性人畜共患病的检测中也得到了进一步应用，如在霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌及结核分支杆菌的检测中，霍乱弧菌是引起霍乱的一种食源性致病菌，人类常因误食海鲜制品而患病。Pengsuk C等［13］建立并评估了检测海鲜制品中霍乱弧菌O139 的免疫试纸条，该试纸条使用了抗霍乱弧菌脂多糖和荚膜多糖的两种单克隆抗体，即VC-273 和VC-812；其中VC-273作为捕捉抗体喷涂在玻璃纤维上与样品垫相连，VC-812和羊抗鼠的IgG 分别作为检测抗体和质控抗体喷涂于硝酸纤维素膜上。评估试验表明，该试纸条的检测敏感性为104CFU／mL，且将检测样品在碱性蛋白胨水中孵育12h后其检测极限可达到1 CFU／mL。金黄色葡萄球菌也是一种重要的人畜共患致病菌，同时也是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，人类常由于误食污染的牛乳而导致食物中毒。布日额等［14］研制了检测牛乳中致病性金黄色葡萄球菌的胶体金试纸条，检测结果表明该试纸条具有较好的特异性、敏感性和稳定性。Wassie L 等［15］研制了一种快速诊断临床肺结核杆菌的免疫层析试纸条，该研究首先通过ELISA 方法筛选到一组能够被肺结核病人血清识别但不与对照组血清反应的抗原，再将这些抗原按照免疫层析方法进行组装，并用组装的试纸条对来自埃塞俄比亚（肺结核高发国家）和土耳其（地方流行区）临床上不同健康状况（包括肺结核感染病人、密切接触病人及健康对照组）人群的血清样品进行检测。结果表明，该方法特异性高达97%以上，但对肺结核的敏感性仅为46%～54%。虽然该方法在临床诊断中敏感性不高，但具有较高的特异性，可为临床检测提供参考。Mdluli P 等［16］利用改进的双通道胶体金免疫层析技术建立了检测肺结核抗体的胶体金试纸条。该试纸条能够更有效的检测全血和血清样品中的结核分支杆菌抗体，且该试验中采用ESE 读数仪对检测线抗体的浓度进行了半定量化，使检测结果更加准确可信。

2 胶体金免疫层析技术在食品药物残留检测中的应用

胶体金免疫层析技术在食品药物残留中的检测不仅包括对抗生素残留、磺胺类药物残留等方面［17］的检测，还包括对三聚氰胺、黄曲霉毒素及地高辛等治疗药物残留的检测。Byzova N A 等［18-19］建立了检测牛奶中氯霉素和链霉素的免疫层析试纸条，并对其敏感性和稳定性进行了优化，氯霉素的检测极限值为10ng／mL。链霉素的检测与传统ELISA 方法符合率在93%以上。另外，Byzova N A 等［20］还建立了检测动物源性食品中氧氟沙星的免疫层析方法。氧氟沙星的检测极限值为30ng／mL，符合食品安全评估的需要，临床检测结果表明该方法不仅能够检测牛奶中的氧氟沙星，而且能够检测鸡肉和猪肉样品中残留的氧氟沙星。Gong Y 等［21］建立了快速检测三聚氰胺的胶体金方法，该研究采用抗三聚氰胺的单克隆抗体为检测抗体，检测极限值为50 mg／L。该方法可用于牛奶、奶粉、肉制品中三聚氰胺的检测，其中牛奶的检测极限值为100 mg／L，奶粉为100ng／g，其他食品为200ng／g。与质谱方法相比，免疫层析法更适用于大量奶制品中三聚氰胺的检测。Gao S等［22］建立了快速检测食品中相思豆毒素的免疫层析方法，该试纸条由鼠抗相思豆毒素A 链的单克隆抗体和兔抗相思豆毒素的多克隆抗体组装而成，该方法可在10 min内得出检测结果，最低检测极限为3ng／mL，且与其他相关的毒素无交叉反应。

为解决目前免疫层析方法检测黄曲霉毒素B1（AFB1）选择性较差的问题，Zhang D 等［23］建立了一种新的检测黄曲霉毒素的免疫层析法，该研究采用了两种特异性更强的单克隆抗体，其中抗黄曲霉毒素B的单克隆抗体AFB（2a）-BSA 和其他文献报道中采用的AFB（1）-BSA 抗体相比，具有更高的特异性，很好的避免了样品检测过程中假阳性的出现；对天然污染的样品如花生、普洱茶、植物油、饲料等农产品的检测结果表明，该方法与高效液相色谱法结果一致，可作为农产品中黄曲霉毒素检测的常用方法。

Omidfar K 等［24］建立了监测病人血液中地高辛的纳米胶体金检测方法，该技术可在5min内完成对地高辛的定量检测，检测时间比放射免疫检测缩短了近20 倍～30 倍，肉眼观察检测敏感度为2ng／mL，该浓度在治疗过程中地高辛有毒浓度以内，血清样品检测的敏感度和精确度与放射免疫测定法结果一致。因此，该方法可作为快速检测血液样品中地高辛的一种新手段。

3 胶体金免疫层析技术在重金属离子检测中的应用

随着工业化程度的不断发展，许多重金属离子持续污染水资源，对环境和人类健康造成了严重的危害。虽然有些重金属离子如铜、锌、铬、锰等为人类必需的微量元素，但过量摄取也会导致机体中毒。目前重金属离子的检测方法有火焰原子吸收光谱、液液萃取、分光光度法、化学发光法等，但这些方法不仅需要昂贵的设备，而且费时费力。免疫层析法不仅具有较强的敏感性和特异性，而且便于操作，因此也广泛用于重金属离子的检测。Liu X［25］建立了检测水和血清样品中Cr3＋和Cr6＋的纳米金层析方法，该方法以亲和纯化的抗螯合剂isothiocyanobenzyl-EDTA（iEDTA）单克隆抗体作为检测抗体，使用0～80ng／mL的铬离子标准品进行检测，结果表明该方法的最低检测限为50.0ng／mL，且能够对血清样品中的铬离子进行检测。该试纸条37 ℃条件下存放12周后，不影响其生物学活性，与其他重金属离子无交叉反应。说明该试纸条具有一定的稳定性和较强的特异性。免疫层析试纸条携带方便、检测迅速，特别适用于铬离子污染水的大量检测及铬离子的生物监测等领域。牡蛎是一种铬含量较高的食物，Nishi K 等［26］建立了检测牡蛎中铬离子的胶体金方法。该研究首先使用0.1mol／L HCl从牡蛎中提取铬离子，采用阴离子交换法去除其他离子。随后采用电感耦合等离子分析技术检测5种金属离子Mn、Fe、Cu、Zn和Cd的含量。检测结果表明，使用HCl能够提取牡蛎中大多数的铬离子，且采用阴离子交换法去除其他离子的过程中不会造成铬离子的损失。该方法检测结果与电感耦合等离子质谱法的一致率为97%。表明该技术是一种可靠的检测牡蛎中铬离子的实用方法。Tang Y 等［27］建立了快速检测水中铅离子的免疫胶体金方法，该方法的最低检测限为50ng／mL。与电感耦合等离子质谱检测平行检测结果表明，该方法具有较强的特异性和敏感性，是一种能够应用于水中铅离子场地快速检测的实用方法。水银是水中最危险的一种污染品，低浓度即能对环境和人类健康造成严重危害。Zhou Y 等［28］建立了检测水中汞离子的竞争免疫层析方法，该方法可在15min内快速检测水中的Hg2＋，且不需对样品进行复杂的样品前处理，不需要精密的仪器和设备。

4 展望

胶体金免疫层析技术是一种新型检测方法，具有简单快速、结果清晰，无需复杂的操作技巧和特殊设备及携带方面等优点。已成为临床快速诊断领域发展的一个新方向。但由于只能用于定性或半定量的检测，难以满足临床检测指标定量化的要求，且靠肉眼判断检测结果，存在灵敏度较低等问题，需要进一步完善。新型胶体金免疫层析技术在以上问题上进行了改进，克服了上述不足。Zhou G 等［29］将棉线等材料引入免疫层析技术中，用棉线和尼龙纤维束代替样品垫和硝酸纤维素膜。并且将棉线和尼龙纤维束进行打结形成框架结构，从而实现了多个样品的高通量检测。不仅如此，该方法还采用平板扫描仪对试验结果进行定量分析，克服了免疫层析法无法定量的缺点。而最新发展的免疫层析技术以特有的光电磁信号放大系统、亲和素-生物素放大技术提高检测灵敏度，减少样品的本底干扰。如荧光乳胶层析技术，在原有免疫层析基础上，在纤维膜上预包被彩色荧光乳胶标记的抗原或抗体，可应用于免疫分析仪检测荧光信号，拥有传统标记物所无法比拟的优势。总之，免疫层析分析技术在满足检测快速而简便的前体下，若能够进一步提高检测的特异度和灵敏度，减少假阴性和假阳性，实现定量检测，必能够在基层临床检测中发挥更大的作用。

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