太子参超低温脱毒及规模化组培育苗技术

戴 军， 姚厚军， 张九玲， 韩邦兴， 陈乃富

(1.皖西学院 生物与制药工程学院 中药研究与开发工程技术研究中心，安徽 六安 237012； 2.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽 六安 237012 )

中药太子参(PseuclostellariaheterophyllaMiq. Pax)来源于石竹科植物太子参的块根，具补气健脾、生津润肺、养阴益血等功效，主治脾虚体倦、病后虚弱、气阴不足、自汗口渴、肺燥干咳等症[1]。太子参主产安徽、福建、贵州等地。太子参由于长期留种栽培，积累了大量病毒，严重影响太子参产量和质量[2, 3]。太子参病毒病无有效防治药物，获得脱病毒太子参植株，进行规模化脱毒太子参育苗是防治太子参病毒病最有效的途径[4, 5]。目前太子参脱病毒及组织培养有较多研究报道，但多数是在实验室条件下研究再生体系[6, 7]，超低温脱毒在植物上运用的研究报道较多[8-17]，但少见超低温脱毒和规模化育苗技术方面的研究，尤其是太子参超低温脱毒和规模化育苗技术方面还未见报道。本文选用太子参幼芽，通过超低温脱毒，采用芽增殖诱导培养，丛生芽诱导培养，壮苗生根培养，形成太子参超低温脱毒及规模化育苗技术体系，实现太子参超低温脱毒及规模化育苗。

1 材料与方法

1.1 实验材料

外植体采自安徽省六安市霍山县太平畈乡王家店村，经皖西学院陈乃富教授鉴定为石竹科植物太子参PseuclostellariaheterophyllaMiq. Pax。外植体选用太子参幼芽。

1.2 实验方法

1.2.1 超低温脱毒

参照香蕉茎尖超低温脱毒方法[18]并经行改良：选取太子参幼芽，将幼芽外层幼叶剥去，取经过表面消毒后的1～1.5 mm幼芽接种到附加140 g/L蔗糖的MS培养基上预培养2 d，然后转接于0℃附加140 g/L蔗糖的MS液体培养基处理40 min，将茎尖置于冷冻管迅速投入液氮，分别保存0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h。从液氮中取出冷冻管，置于40℃水浴解冻1.5 min，备用。

1.2.2 芽增殖诱导培养

经过预处理的幼芽，转入芽诱导培养基中，暗培养7 d后转移到3000 lx的光照强度下培养。40 d后将成活的茎尖转移到不同的培养基上进行再培养。

1.2.3 丛生芽诱导培养

将脱毒后太子参茎尖培养40 d后，转接到增殖培养基上诱导丛生芽，培养20 d丛生芽长至2～3 cm时即可转接到生根培养基上进行生根诱导；丛生芽亦可以切成段转接至增殖培养基上进行丛生芽诱导。

1.2.4 生根壮苗培养

芽条长到2～3 cm时，切下高于2 cm以上的丛生芽，转接生根培养基上进行生根壮苗诱导，其余的转接至增殖培养基上进行丛生芽诱导。

1.2.5 培养基选择和培养条件

培养基：根据不同需要以改良的MS培养基为基本培养基，附加3.0%蔗糖、0.45%琼脂和不同种类、不同浓度的激素，pH调至5.80。

培养条件：温度(25±2)℃ ，光照10 h/d，光照强度3000 lx。

1.2.6 脱毒率检测

将组织培养获得的植株用指示植物法检测[19]脱毒率。

2 结果与分析

2.1 超低温脱毒

由表1可知：对茎尖超低温处理有去除病毒的作用，但会大大降低其成活率；超低温处理时间长短对太子参芽的成活率影响不大，但对脱毒率有一定影响，处理1 h以上脱毒率较高，脱毒率90%以上。从实际生产成本考虑，选择超低温处理1 h(表1)。

表1 超低温处理对成活率及脱毒率影响

注：1、超低温处理后幼芽在芽诱导培养上培养20 d，能分化的幼芽判为成活，反之判为死亡；2、培养90 d后用指示植物法检测脱毒率。

2.2 芽增殖诱导培养

将脱毒太子参幼芽经过暗培养7 d后的外植体转移到3000 lx光照强度下培养40 d后，观察接种于不同诱导培养基上的不定芽数量和状态，结果如表2。

表2 附加激素种类与浓度的培养基对不定芽诱导的影响

由表2可见：附加激素6-BA、IAA的培养基对不定芽诱导有促进作用，当IAA浓度为0.5 mg/L时，随着6-BA的浓度提高，对芽的诱导作用也增强，当增加到2.5 mg/L对芽的诱导作用最强，再增加则对芽的诱导作用有抑制作用。综合生长情况，附加2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA的培养基最适宜诱导不定芽。

表3 含不同激素的培养基对丛生芽的影响

2.3 丛生芽诱导培养

2.3.1 激素种类对丛生芽的影响

初代培养得到不定芽后需要进一步继代增殖才能得到更多的小苗。在初代培养的基础上，进行增殖培养基的调整。将初代培养得到的不定芽切割成单苗接种于继代增殖培养基中。

由表3结果可看出：附加激素1.0 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA和1.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA这两种培养基出芽多，生长快，颜色绿，苗生长粗壮，叶片宽大，结合生长状态附加1.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA的培养基对丛生芽的诱导效果最佳。激素KT对芽的诱导影响强于6-BA。

2.3.2 KT浓度对丛生芽的影响

在筛选出最适激素基础上，进一步研究了KT浓度对丛生芽的影响，结果见表4。随着细胞分裂素KT浓度的升高，丛生芽的增殖倍数不断增加，苗生长的越来越快，长势越来越好。当KT浓度达到1.2 mg/L时，丛生芽增殖倍数最高，出芽快，生长快，苗颜色绿而且粗壮，长势最好。而后随着KT浓度的升高，增殖倍数不断下降，越来越抑制苗的生长。因此，KT浓度为1.2 mg/L左右时是对丛生芽诱导培养的最宜浓度。

表4 不同浓度KT对丛生芽的影响

2.4 壮苗生根培养

将增殖后的太子参苗分别转接于壮苗生根培养基中培养，使其茁壮生长及生根，为炼苗做好准备。

2.4.1 不同激素种类及浓度对壮苗生根培养的影响

表5 不同激素种类对壮苗生根培养的影响

表5结果表明：激素NAA和DA-6均能诱导根的产生，DA-6更适宜壮苗生根培养。DA-6培养出来的苗粗壮，颜色绿，产生的根系也多并且粗壮，部分产生块根，而NAA培养出来的苗纤细，颜色泛黄，虽然可以诱导根的产生，但是根比较纤细。

2.4.2 不同浓度的DA-6对壮苗生根培养的影响

表6 不同浓度的DA-6对壮苗生根培养的影响

由表6可以看出：随着DA-6的浓度增加，对根系诱导作用增强，当浓度为1.5 mg/L时作用最强，浓度超过1.5 mg/L时对根的诱导有抑制作用。当DA-6浓度为1.5 mg/L，KT浓度为0.2 mg/L时是最适宜壮苗生根的培养基，根系发达而且产生块根，更佳利于太子参的生长。

2.4.3 不同有机添加物对壮苗生根培养的影响

表7 不同有机添加物对壮苗培养的影响

由表7可以看出添加有机物对太子参茎叶和根系生长有促进作用，促进块根的形成和生长，有机添加物以蛋白粉最好。

3 讨论

通过超低温对太子参茎尖进行处理，采用以芽诱导丛生芽方式进行增殖，与茎尖分生组织法和热处理结合茎尖分生组织法相比，本方法操作简便、成本低，适宜于太子参规模化脱毒。通过脱毒太子参组培快繁技术研究，优化出适合脱毒太子参诱导芽的培养基为改良MS+2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA；继代增殖最适宜培养基为改良MS+1.2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA；最高增殖倍数可达12.5倍；壮苗生根最适宜培养基为改良MS+0.2 mg/L KT+ 1.5 mg/L DA-6+10%蛋白粉，壮苗生根培养时产生了大量根系及块根。该技术成果成功转化，实现了脱毒太子参规模化育苗。

参考文献：

[1]肖培根，李大鹏，杨世林.新编中药志(第1卷)[M].北京:化学工业出版社，2002. 191-193.

[2]刘清琪，陈绳亮，陈隶华，等.太子参花叶病病原及其防治的初步研究[J].中药材科技， 1983(2)：11.

[3]高 玮，张敬水，张建红，等.太子参花叶病毒的检测与防治[J].中国病毒学，1993，8(4)： 390-393.

[4]宋荣浩，濮祖芹.太子参病毒病的防治途径[J].上海农业学报，1994，10(4)：59-62.

[5]温学森，霍德兰，赵华英.太子参常见病害及防治[J].中药材，2003，26(4)：243-245.

[6]林丛发，钟爱清，魏泽平，等.太子参组培快繁技术研究初报[J].福建农业科技，2002(6)：22.

[7]吴朝峰，马雪梅，林彦铨，等.太子参茎尖脱毒培养及增产效果[J]. 福建农林大学学报，2006，35(2)：130-133.

[8]Drison M, de Boucaud M T, Pierronnet A, et al.Effect of cryopreservation on the sanitary state of acv.Prunus rootstock experimentally contaminated with plum pox potyvirus[J]. Plant Science, 1997, 123:189-196.

[9]Helliot B, Panis B, Poumay Y, et al.Cryopreservation for the elimina-tion of cucumber mosaic and banana streak viruses from banana(Musaspp.)[J]. Plant Cell Reports, 2002, 20:1117-1122.

[10]Wang Q C, Munir M, Li P, et al.Elimination of grapevine virus A(GVA)by cryopreservation of in vitro-grown shoot tips ofVitisviniferaL[J]. Plant Science, 2003, 165:321-327.

[11]Wang Q C, Liu Y, Xie Y H, et al.Cryotherapy of potato shoot tips for efficient elimination of potato leafroll virus(PLRV)and potato virus Y(PVY)[J]. Potato Research, 2006, 49:119-129.

[12]Wang Q C, Valkonen J P T.Efficient elimination of sweetpotato littleleaf phytoplasma from sweetpotato by cryotherapy of shoot tips[J].Plant Pathology, 2008, 57:338-347.

[13]Wang Q C, Valkonen J P T. Elimination of two viruses which interact synergistically from sweetpotato by shoot tip culture and cryotherapy[J]. Journal of Virological Methods, 2008, 154:135-145.

[14]蔡斌华,张计育,渠慎春,等.通过玻璃化超低温处理脱除草莓轻型黄边病毒(SMYEV)研究[J].果树学报,2008,25(6):872-876.

[15]Wang Q C, Wilmer J C, Minna-Liisa R, et al. Combined thermotherapyand cryotherapy for efficient virus eradication:relation of virus distribution,subcellular changes,cell survival and viral RNA degradation in shoot tips[J]. Molecular Plant Pathology, 2008, 9(2):237-250.

[16]Wang Q C, Jari P T V. Cryotherapy of shoot tips:novel pathogen eradi-cation method[J]. Trends in Plant Science, 2009, 14(3):119-122.

[17]曲 先.低温疗法脱除马铃薯病毒及遗传变异分析[D].郑州:河南大学,2009.

[18]吴黎明,曾继吾，彭抒昂，等.香蕉茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生[J].园艺学报，2006，33(3)：501-506.

[19]宋荣浩.太子参病毒病的病原鉴定及防治途径的研究[D].南京:南京农业大学,1987.