基于UFLC-Q-TOF-MS/MS技术的盐酸克林霉素棕榈酸酯分散片杂质的研究*

黄 昕，张 超，周翠兰，邹 威，苏薇薇，彭 维

(1.中山大学生命科学学院，广东 广州510275；2.广州一品红制药有限公司，广东 广州510760)

盐酸克林霉素棕榈酸酯，化学名为6-(1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基)-1-硫代-7(S)-氯-6,7,8三脱氧-L-苏氏-α-D-半乳辛吡喃糖苷-2-棕榈酸酯盐酸盐，是克林霉素的衍生物，体外无抗菌活性，在体内经酯酶水解形成克林霉素而发挥抗菌活性[1]。其在合成过程中会产生一些副产物及降解产物，产生的杂质会导致其抗菌活性降低、毒性增加，影响临床使用效果[2]。因此，有必要对这些杂质进行鉴定和控制。

目前对于盐酸克林霉素棕榈酸酯杂质的研究，主要采用高效液相色谱法(HPLC-UV)和液质联用技术(LC-MS)[1-3]。其中液质联用技术结合了色谱强大的分离能力与质谱优越的定性功能，对药物杂质分析具有无可比拟的优越性。Bharathi等[3]首次分离鉴定了盐酸克林霉素棕榈酸酯中的10种杂质，王建等[2]采用HPLC-ESI-MSn法鉴定了国产盐酸克林霉素棕榈酸酯原料药中的3个新杂质。但是，由于药物中某些杂质含量极低，迫切需要一种更灵敏、更精确的手段对其进行检测，以确保药物的安全性。目前新一代的超快速高效液相色谱串联时间飞行质谱技术(UFLC-Q-TOF-MS/MS)，集快速有效的分离能力和高分辨、高质量精度的定性能力为一体，已成为研究微量药物杂质的最有效手段之一[4]，笔者采用该技术对盐酸克林霉素棕榈酸酯分散片中的杂质进行了鉴定，共检出16种杂质，其中4种杂质为首次检出。本研究对确保药品安全性、质量可控性具有重要意义，为国内药品质量控制提供了示范。

1 仪器与试药

超快速高效液相色谱仪(LC-20AD-XR二元泵，SIL-20AD-XR自动进样器，CTO-20A柱温箱，日本岛津公司)；四级杆-飞行时间质谱仪(AB SCIEX Triple TOF 5600，美国应用生物系统公司)；超纯水系统(Simplicity SIMS00000，美国密理博公司)。

盐酸克林霉素棕榈酸酯对照品(CAT. NO. 1137005 USP ROCKVILLE，MD LOT H01037，以克林霉素计含595 μg/mg或w=59.5%)；克林霉素B棕榈酸酯对照品(浙江海翔药业股份有限公司，批号101025)；盐酸克林霉素棕榈酸酯分散片(规格75 mg/片，广州一品红制药有限公司，批号20130301，20130302，20130303)；甲醇(色谱纯，Burdick & Jackson)、乙腈(光谱纯，Burdick & Jackson)、醋酸铵(HPLC级，Fluka，17836-50G)。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取盐酸克林霉素棕榈酸酯分散片细粉适量，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL中约含克林霉素0.57 mg溶液，滤过，作为供试品溶液；取盐酸克林霉素棕榈酸酯对照品，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释成每1 mL中含克林霉素2.22 mg的溶液，作为对照品溶液。取克林霉素B棕榈酸酯对照品，精密称定，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释成每1 mL中含克林霉素0.50 mg的溶液，作为杂质对照品溶液。

2.2 液相色谱分析条件[2]

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8(3×150 mm, 3.5 μm)，流动相A为5 mmol/L醋酸铵溶液-乙腈(体积比为50∶50)，流动相B为乙腈(洗脱梯度见表1)，流速：0.4 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：2 μL。

表1 液相色谱流动相梯度洗脱条件Table 1 HPLC mobile phase gradient elution conditions

2.3 质谱条件

选用ESI作为电离源。采用正离子模式同时进行一级和二级扫描。离子喷雾电压：1 500 V；离子源气体：60 psi；离子源温度：550 ℃；碰撞器压力：8 psi。检测结果见表2。

表2 盐酸克林霉素棕榈酸酯分散片中的杂质Table 2 Impurities in clindamycin palmitate hydrochloride dispersible tablets

2.4 杂质解析

杂质1：准分子离子峰[M+H]+为m/z425.187 2。对其进行子离子解析，m/z377.183 1推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH产生，m/z126.127 6为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为(图1)和参考文献[2-3]，故鉴定该化合物为克林霉素，分子式为C18H33ClN2O5S。

图1 克林霉素正模式下一级扫描图(a)、二级碎片质谱图(b)及断裂途径(c)Fig.1 (a)MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of clindamycin, and (c) the mass fragmentation pathways

杂质2：准分子离子峰[M+H]+为m/z465.218 0。对其进行子离子解析，m/z417.218 7推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.127 4为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为(图2)和参考文献[2]，故鉴定该化合物为丙叉克林霉素，分子式为C21H37ClN2O5S。

杂质3：准分子离子峰[M+H]+为m/z565.307 3。对其进行子离子解析，m/z517.324 8推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.128 9为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为和参考文献[2-3]，故可鉴定该化合物为克林霉素九酸酯，分子式为C27H49ClN2O6S。

杂质4：准分子离子峰[M+H]+为m/z579.322 9。对其进行子离子解析，m/z531.320 7推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.126 8为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为和参考文献[2-3]，故可鉴定该化合物为克林霉素十酸酯，分子式为C28H51ClN2O6S。

图2 丙叉克林霉素正模式下一级扫描图(a)、二级碎片质谱图(b)及断裂途径(c)Fig.2 (a)MS and (b) MS/MS in positive mode of anisylidene clindamycin， and (c) the mass fragmentation pathways

杂质5：准分子离子峰[M+H]+为m/z679.411 7。对其进行子离子解析，m/z615.411 8推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SOH 产生，m/z126.127 7为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为(图3)和参考文献[2]，故鉴定该化合物为亚砜克林霉素棕榈酸酯，分子式为C34H63ClN2O7S。

杂质6：准分子离子峰[M+H]+为m/z593.338 6。对其进行子离子解析，m/z545.333 1推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.128 4为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为和参考文献[2-3]，故可鉴定该化合物为克林霉素十一酸酯，分子式为C29H53ClN2O6S。

图3 亚砜克林霉素棕榈酸酯正模式下一级扫描图(a)、二级碎片质谱图(b)及断裂途经(c)Fig.3 (a)MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of sulfoxides clindamycin palmitate hydrochloride and (c) the mass fragmentation pathways

杂质7：准分子离子峰[M+H]+为m/z645.450 7。对其进行子离子解析，m/z597.448 3推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.128 0为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为(图4)和参考文献[3]，故可鉴定该化合物为林可霉素棕榈酸酯，分子式为C34H64N2O7S。

图4 林可霉素棕榈酸酯正模式下一级扫描图(a)、二级碎片质谱图(b)及断裂途径(c)Fig.4 (a) MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of Lincomycin palmitate, and (c) the mass fragmentation pathways

杂质8：准分子离子峰[M+H]+为m/z607.354 2。对其进行子离子解析，m/z559.350 5推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.127 7为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为和参考文献[2]，故可鉴定该化合物为克林霉素十二酸酯，分子式为C30H55ClN2O6S。

杂质9：准分子离子峰[M+H]+为m/z621.369 9。对其进行子离子解析，m/z573.365 3推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.128 1为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为和参考文献[2]，故可鉴定该化合物为克林霉素十三酸酯，分子式为C31H57ClN2O6S。

图5 棕榈酸乙酯正模式下一级扫描图(a)、二级碎片质谱图(b)及断裂途径(c)Fig.5 (a) MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of ethyl palmitate, and (c) the mass fragmentation pathways

图6 克林霉素B棕榈酸酯正模式下一级扫描图(a)、二级碎片质谱图(b) 及断裂途径(c)Fig.6 (a) MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of ethyl palmitate, and (c) the mass fragmentation pathways

杂质11：准分子离子峰[M+H]+为m/z635.385 5。对其进行子离子解析，m/z587.388 1推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.127 8为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为和参考文献[2]，故可鉴定该化合物为克林霉素十四酸酯，分子式为C32H59ClN2O6S。

杂质12：准分子离子峰[M+H]+为m/z663.416 8。对其进行子离子解析，m/z615.411 7推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.127 8为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为和参考文献[2-3]，故可鉴定该化合物为克林霉素棕榈酸酯异构体，分子式为C34H63ClN2O6S。

杂质13：准分子离子峰[M+H]+为m/z649.401 2。对其进行子离子解析，m/z601.394 1推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z112.111 5为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C7H3N]+。该化合物的保留时间、精确相对分子质量、质谱行为(图6)与对照品一致[2-3] ，故可鉴定该化合物为克林霉素B棕榈酸酯，分子式为C33H61ClN2O6S。

杂质14：准分子离子峰[M+H]+为m/z677.432 5。对其进行子离子解析，m/z629.429 6,推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.127 8为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为和参考文献[2-3]，故可鉴定该化合物为克林霉素十七酸酯，分子式为C35H65ClN2O6S。

杂质15：准分子离子峰[M+H]+为m/z691.448 1。对其进行子离子解析，m/z643.445 1推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.128 2为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为和参考文献[2-3]，故可鉴定该化合物为克林霉素十八酸酯，分子式为C36H67ClN2O6S。

杂质16：分子离子峰[M+H]+为m/z703.448 1。对其进行子离子解析，m/z655.329 6推测为准分子离子峰经裂解脱去1个中性分子CH3SH 产生，m/z126.128 1为克林霉素吡咯环的特征碎片离子[C8H5N]+。根据该化合物的精确相对分子质量、质谱行为和参考文献[2]，故可鉴定该化合物为丙叉克林霉素棕榈酸酯，分子式为C37H67ClN2O6S。

3 讨 论

在本研究中，检测出盐酸克林霉素棕榈酸酯分散片中的16种杂质，其中克林霉素九酸酯、克林霉素十酸酯、克林霉素十一酸酯、克林霉素十三酸酯为首次检到。经二级质谱分析指认，所检测到的杂质均为脂肪酸类物质或克林霉素与脂肪酸的结合物，他们是盐酸克林霉素棕榈酸酯合成过程中所产生的副产物，在产品的质量控制中，必须对其进行监控。

本文采用UFLC-Q-TOF-MS/MS技术对盐酸克林霉素棕榈酸酯分散片中的杂质进行鉴定，将液相色谱的高效在线分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度的检测能力相结合，具有分辨率高、灵敏度高、分析时间短的特点[5-7]，能检测到更多的杂质，为进一步加强药品生产工艺过程的质量控制提供了依据。在有关物质的分离与鉴定中，具有巨大的优越性，值得推广应用。

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