糖结合单元－绿色荧光蛋白探针的制备及应用

王 雪， 李丽丽， 杨 兰， 李宪臻， 杨 帆

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

利用木质纤维素发酵生产生物燃料、化学品以及其他生物基产品，对于实现能源的可持续性开发、拉动农业及其他相关行业的经济发展有着重要意义［1－2］。木质纤维素中含有丰富的纤维素和半纤维素，需要先经过物理法、化学法、物理化学法或酶法预处理成为可发酵性糖，才能被微生物利用［3－4］。木质纤维素的预处理程度，直接影响着后续发酵的效率。因此，对木质纤维素经预处理后所暴露的结晶和非结晶纤维素含量以及发酵性糖的产率的表征逐渐成为国内外研究热点［5］。

CBMs（carbohydrate－binding modules）作为重要的纤维素水解酶非催化糖结合单元，能够结合到纤维素、木聚糖、甘露聚糖、葡聚糖、半乳糖体以及其他复杂聚糖上［6－7］。已有学者利用 CBMs－青色荧光蛋白融合体来研究脱木素处理的木材中木质纤维素水解起始位点［5］。该研究为利用CBMs评估木质纤维素预处理效果提供了新思路。

本工作将来源于约式梭菌Clostridium josui的家族28糖结合单元（CjCBM28）与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）进行了融合表达，制备了CjCBM28－GFP探针，并考察了该探针对经离子液体预处理及未预处理玉米秸秆的结合能力。

1 试 验

1.1 材料与仪器

Escherichia coli DH5α、pMD18－T载体，大连宝生物有限公司；E.coli BL21 （DE3）、质粒pET－DLDH－GFP，获赠于大连化学物理研究所赵宗保研究员课题组。

r Taq DNA Polymerase，PrimeSTAR HS DNA Polymerase，250bp DNA Marker，1kp DNA Marker，限制性内切酶等，大连宝生物有限公司；DpnI，NEB公司。

LB液体培养基（胰蛋白胨10.0g／L，酵母提取物5.0g／L，氯化钠10.0g／L）；LB固体培养基（琼脂粉15.0g／L，其余同LB液体培养基）。

JY92－IIN超声破碎仪，宁波新芝生物技术有限公司；AKTA蛋白质纯化系统，GE healthcare；尼康荧光显微镜80i。

1.2 试验方法

1.2.1 编码CjCBM28的核苷酸序列的合成

全长为579bp的CjCBM28核苷酸序列由上海生工生物技术有限公司进行全基因合成，合成的片段被亚克隆至pUC57，构成pUC57－CjCBM28。

1.2.2 引物设计

CjCBM28基因克隆、CjCBM28－GFP表达载体构建及鉴定所用引物均合成于大连宝生物有限公司。引物序列及功能如表1所示。

表1 引物序列及功能Tab.1 Sequences and functions of primers

1.2.3 CjCBM28－GFP探针表达载体构建

为了获得带有GFP－CjCBM28表达载体（图1），以合成构建的pUC57－CjCBM28为模板，以表1所示引物进行Restriction Free cloneⅠ反应（RFⅠ）［8］，扩增产物经过胶回收，利用RFⅡ反应将质粒pET－DLDH－GFP中DLDH基因替换为CjCBM28以获得pET－GFP－CjCBM28表达载体。取9μL产物加入DpnI（20U／μL）1μL，37℃保温3h以消化甲基化的母本质粒。取10μL消化产物电击转化至E.coli DH5α感受态细胞中，转化菌液在含有100μg／mL ampicillin的LB固体培养基上于37℃培养约12h，挑取阳性克隆提取质粒并测序以确定重组质粒的正确性。

图1 质粒pET－CBM－GFP示意图Fig.1 The map of plasmid pET－CBM－GFP

1.2.4 CjCBM28－GFP融合蛋白质的表达纯化

将表达质粒pET－CBM－GFP电击转化至BL21（DE3）感受态细胞中。挑取转化子进行菌落PCR鉴定，鉴定引物 CBM－GFP－H1和CBMGFP－H2。菌落PCR鉴定正确的转化子进行蛋白质的表达。

BL21（DE3）－CBM28－GFP种子液1∶100转接于1L含相应抗生素的LB培养基，37℃、200r／min培养至OD600nm为0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol／L；16℃、200r／min诱导20h；5 000r／min离心6min收集菌体；70mL Native bind buffer重悬菌体，重悬菌液采用超声破碎细胞，小心沿着Ni－NTA填料柱内壁用吸管缓慢加入细胞破碎上清，打开三通阀至加入的上清液完全浸入到填料中，关上三通阀，令上清液与填料充分结合约20min，流加bind buffer 400mL（约8个柱体积），流加400mL wash buffer至洗出液无蛋白质。流加elution buffer，监测穿刺液中蛋白质浓度，适时收集目的蛋白质［9］。蛋白质浓度根据BSA标准曲线采用考马斯亮蓝法进行测定［10］。

1.2.5 CjCBM28－GFP融合蛋白质对纤维素的结合能力

分别称取离子液体预处理的秸秆粉末0.010 6g及未经离子液体预处理的秸秆粉末0.012 1g，用1mL 20mmol／L Tris－Cl（pH 7.4）重悬。在悬液中加入100μL纯化的CjCBM28－GFP融合蛋白探针，30℃、200r／min温育3h。10 000r／min离心5min，收集的秸秆在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的结合程度。

2 结果与讨论

2.1 编码CjCBM28的核苷酸序列的全基因合成

由上海生工合成的带有CjCBM28核苷酸序列的pUC57－CjCBM28送TaKaRa公司测序，利用软件DNAStar中的Meg Align程序将测序结果与genebank提交的CjCBM28核苷酸序列进行比对，结果表明全基因合成的579bp的核苷酸序列完全正确（图2）。

2.2 GFP标记的CjCBM28探针表达载体构建

为了构建CjCBM28－GFP表达载体pETCBM－GFP，采用RF克隆方法将母本质粒pETDLDH－GFP中GFP上游原有的融合蛋白替换为CjCBM28。RF反应结果如图3所示，重组质粒的NdeⅠ酶切鉴定结果如图4所示。结果表明，pETCBM－GFP 3＃、4＃、5＃酶切条带正确，相应的测序结果也正确。因此，CjCBM28成功地将原质粒中的序列替换，pET－CBM－GFP表达载体构建成功。

图2 全基因合成CjCBM28核苷酸序列（pUC57－cbm28）与数据库序列（CBM28－synthesis）比对结果Fig.2 Sequence alignment of synthesized CjCBM28DNA and the gene data from GeneBank

图3 pET－CBM－GFP表达载体构建扩增结果Fig.3 Construction result of pET－CBM－GFP

图4 pET－CBM－GFP表达载体酶切鉴定结果Fig.4 Restriction identification result of pET－CBM－GFP

2.3 CjCBM28－GFP融合蛋白质的表达纯化

将鉴定正确的表达质粒pET－CBM－GFP电击转化至BL21（DE3）感受态细胞中，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，结果表明（图5），所有的转化子均含有正确的表达质粒。

图5 pET－CBM－GFP转化BL21（DE3）菌落PCR鉴定结果Fig.5 In situ PCR result of pET－CBM－GFP／BL21（DE3）recombinants

将正确pET－CBM－GFP／BL21（DE3）转化子发酵液上清目的蛋白质利用Ni－NTA进行亲和纯化，结果如图6所示。所获得的纯化的CBMGFP条带较为单一，杂蛋白被有效地去除，目的蛋白CjCBM28－GFP分子质量约为49ku，浓度也符合要求。经考马斯亮蓝法检测纯化的CBMGFP融合蛋白质质量浓度为3.44mg／mL，共得到纯化液17.5mL，总蛋白约60mg。

图6 CBM－GFP纯化SDS－PAGE电泳结果Fig.6 SDS－PAGE result of the purification of CBM－GFP

2.4 CjCBM28－GFP融合蛋白质对木质纤维素的结合能力

将未经处理的以及离子液体预处理的玉米秸秆粉末与纯化的CjCBM28－GFP融合蛋白探针混合，30℃、200r／min温育3h，离心。通过肉眼观察可发现预处理的秸秆粉与蛋白质探针结合的离心上清较未预处理的秸秆粉末探针结合离心上清荧光绿色浅。对CjCBM28－GFP融合蛋白探针结合的未经处理以及离子液体预处理的玉米秸秆粉末离心沉淀进行荧光检测。结果表明，经离子液体预处理的秸秆结合了大量CBM－GFP，发出较强的绿色荧光，而未经处理的秸秆只有边缘结合少量CjCBM28－GFP，发出微弱绿色荧光（图7）。

3 结 论

构建并表达纯化了绿色荧光蛋白与家族28糖结合单元融合的CjCBM28－GFP探针。未处理及经离子液体预处理的玉米秸秆与CjCBM28－GFP温育后的荧光镜检结果表明，较之未经处理的玉米秸秆，离子液体预处理的玉米秸秆暴露出大量线性化纤维结构，可被CjCBM28定点识别并结合。该工作为测定木质纤维素经预处理后所暴露的结晶和非结晶纤维素含量、分析不同方式预处理的木质纤维素的水解程度以及发酵性糖的产率的计算打下基础。

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