异Vc钠生产废液复合玉米秸秆发酵生产高蛋白饲料研究

王风芹， 李传斌， 张 瑞， 张雷鸣， 谢 慧， 宋安东

(河南农业大学生命科学学院，农业部农业微生物酶工程重点实验室，河南 郑州 450002)

随着我国畜牧业的持续高速发展，饲料需求量不断增加，其中蛋白质饲料更是重中之重.玉米秸秆是草食家畜主要的饲料来源，但秸秆粗纤维含量高，蛋白质、矿物质和可溶性碳水化合物含量低，畜禽消化率低，适口性差，直接用于养殖业效率极低[1,2].因此，以玉米秸秆为原料固态发酵生产单细胞蛋白饲料受到人们的广泛关注[3～7].异Vc钠是目前食品工业上广泛使用的抗氧、防腐、保鲜剂[8]，在其生产过程中会产生大量生产废液，如郑州市某生物化工厂年产异Vc 钠3 000 t，对废水进行达标处理后，每天仍有10余t高浓度制药废水的浓缩液剩余[9].该生产废液是一种棕黑色、富含大量有机质、高盐、粘稠的酸性液体(pH值4.1～4.6)[10]，若能对其进行资源化利用，不仅可以减轻环境压力，还可提高其经济价值.本研究首先对分离得到的耐高浓度异Vc钠生产废液(Waste Water of Sodium Erythorbat Production,WEP)中的菌株进行鉴定，并利用该菌株和白地霉对玉米秸秆复合WEP进行混菌固态发酵生产高蛋白饲料，以期提高玉米秸秆和WEP的利用价值.

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 玉米秸秆 风干并粉碎至40目备用.其组成成分如下：纤维素32.30%，半纤维素18.81%，木质素14.56%，真蛋白4.34%，粗蛋白5.35%.

1.2菌种

白地霉(Geotrichumcandidum)，由本实验室分离、保存.

1.3培养基

1.3.1 固态发酵培养基 5 g玉米秸秆，1 g麸皮，固液比1∶4(液体使用15% WEP，即将WEP稀释至原液含量为15%，并在稀释液中添加5 g·L-1硫酸铵，5 g·L-1磷酸二氢钾，1 g·L-1的硫酸镁，pH值调至4.5)，混合均匀后于121 ℃灭菌15 min.

1.3.2 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏0.3 g、蛋白胨0.5 g、NaCl 0.5 g、琼脂2 g、水100 mL，调pH值7.2～7.4，121 ℃灭菌15 min.

1.3.3 PDA培养基 去皮马铃薯20 g，加水煮沸30 min，过滤取汁，加葡萄糖2 g，蒸馏水定容至100 mL，琼脂2%，121 ℃灭菌15 min.

1.3.4 麸皮浸汁种子液 10%的麸皮浸汁，2%的葡萄糖，121 ℃灭菌15 min.

1.4耐高盐菌株的分离与鉴定

1.4.1 富集培养与分离 配制10%～20% WEP固态发酵培养基(培养基组成同1.3，其中所用WEP稀释液中原液含量为10%～20%)，不灭菌，于28 ℃下培养2 d，挑取生长旺盛的优势菌在牛肉膏蛋白胨或PDA固体培养基(培养基配制时所用液体为相应浓度的WEP稀释液，不加无机盐，见1.3)上反复划线分离，直至得到单菌落.取培养2 d的牛肉膏蛋白胨(细菌)或PDA(真菌)斜面菌种，加入5 mL无菌生理盐水制取菌悬液或孢子悬液，接种0.5 mL到固体发酵培养基(见1.3)中，搅拌均匀，于28 ℃发酵2 d，60 ℃烘干，测定真蛋白含量.

1.4.2 菌种鉴定

1.4.2.1 形态鉴定 接种供试菌株于PDA平板上，28 ℃培养2 d后观察菌落形态，利用水浸片法于普通光学显微镜下观察孢子着生情况及其形态，对比《真菌鉴定手册》[11]初步确定其分类地位.

1.4.2.2 生理生化鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》[12].

1.4.2.3 系统发育研究 将供试菌株接种入PDA液体培养基中，28 ℃、140 r·min-1培养24 h后用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗3～5次，挤干水分.称取0.5 g菌丝于无菌研钵中，采用CTAB法进行DNA提取[13].18S rDNA基因PCR扩增的正向引物序列为：’-GATCCTGC CAGTAGTCA TATG-3’；反向游引物序列为：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’，由上海生物工程有限公司合成.PCR反应体系为：Reaction Buffer(10×)5.0 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)4.0 μL，正向引物(10 μmol·L-1)2.0 μL，反向引物(10 μmol·L-1)2.0 μL，Taq聚合酶(5 U·μL-1)0.5 μL， DNA 50 ng，超纯水补至50.0 μL，dNTPs及Taq聚合酶均购自天根生化有限公司.PCR反应程序为：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，52.8 ℃，45 s，72 ℃，50 s，30个循环；72 ℃，10 min.1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，后送大连宝生物工程有限公司进行测序.将测序所得序列及GeneBank中获得的参比菌株的相应基因序列经ClustalX序列比对后，采用TREECONW中的邻接法(Neighbor-joining)进行系统发育树的构建，自展值(bootstrap)为1000.

1.5供试菌株和白地霉混菌固态发酵正交试验

从马铃薯琼脂斜面上挑一环孢子到装有50 mL麸皮浸汁种子液的300 mL锥形瓶中，28 ℃、140 r·min-1培养24 h作种子液，接种0.5 mL种子液(白地霉∶Z2=1∶1)到固态发酵培养基中，搅拌均匀，28 ℃发酵2 d，发酵结束后测定发酵物料中的真蛋白含量.为了确定混菌固态发酵工艺的相关参数，选择发酵时间、发酵温度、固液比、硫酸铵含量和初始pH值进行L16(45)正交试验，各处理设置3个重复.试验因素水平见表1.

表1 混菌固态发酵正交试验因素和水平表

1.6测定方法

1.6.1 蛋白含量测定 称取一定量于60 ℃烘干至恒重，取0.5 g烘干样品用10%三氯乙酸浸泡15 min以沉淀蛋白质，定性滤纸过滤，去离子水洗3～4次，70 ℃烘干，按常量凯氏定氮法测定真蛋白含量[14～16]，粗蛋白含量直接采用凯氏定氮法测定.

1.6.2 纤维素、半纤维素和木质素的测定 采用万良玉改良法测定[17]，降解率D=(X0-X)/X0×100%，其中，X0指未发酵物料经烘干后纤维素或半纤维素含量，X指物料经发酵并烘干后纤维素或半纤维素含量.

1.6.3 还原糖的测定 取约0.5 g 60 ℃烘干的发酵料，用100 mL蒸馏水搅拌、浸泡10 min，定量滤纸过滤，取滤液采用DNS比色法[18]测定还原糖质量浓度A，样品中还原糖含量计算公式：样品中还原糖含量(mg·g-1)=100×A/w，其中：A为滤液还原糖质量浓度(mg·L-1)；w为样品质量(g).

1.7数据处理

试验结果采用SPSS 16.0统计软件进行方差分析和差异显著性分析.

2 结果与分析

2.1耐WEP菌株的分离

在28 ℃自然培养2 d的15%WEP固体发酵料上有微生物旺盛生长，采用稀释平板分离法分离优势菌种，并经多次分离纯化得到1株真菌，命名为Z2.利用该菌株进行固态发酵，28 ℃发酵2 d后发酵物料中真蛋白含量为5.90%，比对照(未发酵培养料)提高19.7%，表明该菌株不仅耐受15%的WEP，还可以显著提高发酵物料中的蛋白质含量.

2.2菌种鉴定

2.2.1 形态鉴定 Z2菌株的菌落为白色绒毛状，质地疏松，生长迅速，28 ℃、48 h可长满整个平板，但37 ℃不生长；孢囊梗单生，孢子囊为洋梨形，多孢子，不弹射；孢囊孢子为卵形，呈灰褐色(图1).根据其形态特征对照《真菌鉴定手册》[11]认定Z2应属于毛霉目，毛霉科.该菌株可以利用蔗糖、木糖、乳糖、果糖、山梨醇、葡萄糖、淀粉等为唯一碳源，但不能利用微晶纤维素.

A. 菌落；B. 孢子囊；C. 孢子释放；D. 孢子(×400)

2.2.2 系统发育地位确定 对Z2菌株的18S rDNA进行PCR扩增、序列测定，得到长度为2 135 bp的18S rDNA部分基因序列.对Z2菌株及其相关参比菌株的18S rDNA序列进行比对，并构建系统发育树(图2)，由图2可以看出Z2菌株属于毛霉目、毛霉科、犁头霉属，与伞枝犁头霉(Absidiacorymbifera)NRRL28639和Absidiaidahoensisvar.ThermophilaFSU6197位于同一个系统发育分支，同源性分别达到99%和98%.因此将Z2菌株归为犁头霉属(Absidia).

图2 Z2菌株与相关参比菌株的系统发育树

2.3Z2和白地霉混菌固态发酵条件优化

白地霉菌体蛋白质含量高，且能产生独特的芳香气味，是饲料发酵中的常用菌种，本研究采用Z2和白地霉进行混菌固态发酵.通过正交试验研究了固态发酵过程中发酵时间(A)、发酵温度(B)、固液比(C)、硫酸铵含量(D)和初始pH值(E)对发酵物料中蛋白质含量的影响，结果见表2和表3.对发酵物料中真蛋白含量影响最大的是发酵时间，其次是温度和固液比，初始pH值影响最小，最优组合为：A2B2D4C2E3，即发酵温度28 ℃，硫酸铵添加量1 g·L-1，固液比1∶4，初始pH值为5.5，发酵4 d.该组合不是正交试验中的已有组合，因此对该最优组合进行了发酵验证试验，结果见表4.在此条件下，发酵后真蛋白含量达62.5 mg·g-1，比对照提高了26.01%，且高于正交试验中所有试验组；粗蛋白含量为101.2 mg·g-1，比对照提高了22.96%.物料经Z2和白地霉混菌固态发酵后的物理状态见图3，湿料内外都有大量的白色菌丝，并伴有醇香味.60 ℃烘干后，表面呈黄褐色，有干香味.

表2 正交实验结果及极差分析表

表3 正交试验方差分析表

表4 正交试验优化条件的发酵验证结果

A.湿料； B.干料

2.4发酵物料关键组分变化分析

2.4.1 真蛋白和还原糖含量变化趋势 Z2和白地霉在最优发酵条件下混菌发酵，每隔12 h取样1次，60 ℃烘干，测定发酵产品的还原糖和真蛋白含量，发酵过程中二者均呈现先升高后降低的趋势(图4)，分别在发酵的60 h和96 h达到最大值341.5 mg·g和62.5 mg·g-1，其中真蛋白含量比发酵前提高了26.01%.

图4 发酵过程中还原糖和真蛋白含量的变化趋势

2.4.2 木质素、纤维素和半纤维素含量测定 为考察发酵前后发酵物料中纤维素、半纤维素和木质素成分的变化，对发酵前(0 h)和发酵后(96 h)物料中的纤维素、半纤维素和木质素含量进行测定，结果见表5.混菌固态发酵后，发酵料中纤维素、半纤维素的降解率分别为11.20%和8.57%，但木质素的降解率仅为0.73%.

表5 发酵前后发酵料中相关成分的变化

3 结论与讨论

3.1结论

1)耐WEP菌株的分离及鉴定：获得1株能在15%WEP中旺盛生长的犁头霉菌株Z2，玉米秸秆和WEP混合物经该菌株发酵后，真蛋白含量为59.0 mg·g-1，提高了19.7%.

2)Z2和白地霉混菌固态发酵条件优化：秸秆∶麸皮=5∶1，固∶液(15% WEP，添加1 g·L-1硫酸铵，0.5 g·L-1磷酸二氢钾，0.1 g·L-1的硫酸镁)=1∶4，初始pH值5.5，28 ℃，发酵4 d.在此条件下发酵产物真蛋白含量为62.5 mg·g-1，粗蛋白含量为101.2 mg·g-1，分别比对照提高26%和22.96%.

3)发酵产品特性：玉米秸秆经发酵后纤维素和半纤维素均得到了适度降解，提高了其作为饲料的营养价值和可消化性.

3.2讨论

本研究以异Vc生产废液复合玉米秸秆为原料发酵生产高蛋白饲料，提出了异Vc钠生产废液资源化利用的新途径.但由于异Vc钠生产废液中无机盐含量较高，不利于微生物的生长与发酵.通过富集培养、分离筛选得到1株犁头霉菌株Z2，该菌株能够在15%的WEP培养基上良好生长，其中含有1.4%的Na+，相当于3.54%的NaCl.通过条件优化，利用白地霉和Z2菌株混菌发酵WEP和玉米秸秆后发酵物料中真蛋白含量为62.5 mg·g-1，粗蛋白含量为101.2 mg·g-1，比对照分别提高了26.0%和22.96%，纤维素和半纤维素降解率分别为11.20%和8.57%，提高了玉米秸秆作为饲料的营养价值和可消化性，发酵后的产品色、香、味较好，对提高动物的采食量很有益处.据测算，发酵料中灰分含量约为180～200 mg·g-1，Na含量约为50～60 mg·g-1，Cl含量为4 mg·g-1，因此高灰分、高盐含量是该发酵产品的局限，作为饲料使用时应与其它饲料进行适当的复配，或发酵时减少WEP的使用量以降低发酵产品中灰分和盐含量.

参考文献：

[1]岳建芝,张 杰,徐桂转,等.玉米秸秆主要成分及热值的测定与分析[J].河南农业科学,2006(9):30-32.

[2]邢廷铣.农作物秸秆三级饲料化利用技术的概念和应用[J].粮食与饲料工业,1999(1):31-32.

[3]JWANNY E W,RASHAD M M,ABDU H M. Solid-state fermentation of agricultural waste into food throughPleurotuscultivation[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,1995,50(1): 71-78.

[4]陈金钟,邬苏焕,宋兴福.泔脚与秸杆混合发酵法生产蛋白饲料的新工艺流程[J].上海环境科学,2003,22(12): 998-1000.

[5]张伟心,马艳玲,霍玉鹏.混合菌发酵玉米秸秆生产菌体蛋白饲料的研究[J].饲料研究,2000(6):5-7.

[6]刘剑虹,陈庆森,陈剑勇,等.酸处理玉米秸秆生物转化单细胞蛋白的研究[J].天津商学院学报,2001,21(3): 1-5.

[7]GAO P J,QU Y B,ZHAO X,et al. Screening microbial strain for improving the nutritional value of wheat and corn straws as animal feed [J]. Enzyme and Microbial Technology,1997,20(8): 581-584.

[8]顾立新,王元春,王健祥.异维生素C钠一步法合成工艺研究[J].化学世界,1999(5):251-253.

[9]潘 峰,时 蕾,刘鲲鹏. 异Vc 钠制药废渣、浓残液实验分析与综合利用探讨[J].河南师范大学学报:自然科学版,2009,37(5): 94-96.

[10]张雷鸣,万续良,王风芹,等.玉米淀粉糖蜜残夜的资源化利用探讨[J].食品工业科技,2010,31(5):374-376.

[11]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.

[12]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社,2001:349-398.

[13]GUO L D,HYDE K D,LIEW E C Y. Identification of endophytic fungi fromLivistonachinensisbased on morphology and rDNA sequences[J]. New Phytologist,2000,147: 617- 630.

[14]严永忠.改进粗蛋白测定方法的探讨[J].湖南饲料,2004(4):29.

[15]马 丹.凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量[J].计量与测试技术,2008,35(6):57-58.

[16]周国顺.饲料真蛋白的定量检测[J].中国饲料,1996(7):33.

[17]宋安东.生物质(秸秆)纤维燃料乙醇生产工艺试验研究[D].郑州:河南农业大学,2003.

[18]董晓燕.生物化学试验[M].北京:化学工业出版社,2003.