心肾不交所致失眠大鼠模型

郜红利， 涂 星， 卢 映， 孙敏红， 张 方

（1.湖北民族学院中医药学院， 湖北 恩施 445000； 2.广州中医药大学第一临床医学院， 广东 广州510405；3.湖北省恩施州疾病控制中心， 湖北 恩施 445000； 4、湖北省恩施自治州优抚医院，湖北 恩施445000）

心肾不交所致失眠大鼠模型

郜红利1， 涂 星2*， 卢 映2， 孙敏红3， 张 方4

（1.湖北民族学院中医药学院， 湖北 恩施 445000； 2.广州中医药大学第一临床医学院， 广东 广州510405；3.湖北省恩施州疾病控制中心， 湖北 恩施 445000； 4、湖北省恩施自治州优抚医院，湖北 恩施445000）

目的 建立同时符合中医 “心肾不交” 和下丘脑-垂体-肾上腺轴紊乱的失眠大鼠模型。 方法 采用母乳鼠分离法、 多种焦虑刺激和腹腔注射对氯苯丙氨酸造失眠模型, 并考察受试大鼠的一般行为学、 血象及血浆 Orexin、 促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH)、 促肾上腺皮质激素 (ACTH) 的水平。 结果 模型组大鼠睡眠时间显著减少, 目光呆滞,双目、口唇呈苍白色,爪甲较光滑,皮毛重度枯槁蓬乱；血象检查血浆中红细胞数目和血红蛋白水平显著降低；血浆中 ACTH、 Orexin、 CRH水平显著性升高。 结论 本实验的失眠大鼠模 型能体现了 “ 心肾不交” 所致下 丘脑-垂体-肾上腺轴内分泌紊乱的失眠发生特点。

失眠； 心肾不交； 下丘脑-垂体-肾上腺轴； 动物模型； 激素分泌

失 眠 (insomnia) 是 指 患 者 对 睡 眠 时 间 和(或) 睡眠质量不满足并影响白天社会功能的一种主观体验［1］。 研 究 表 明, 应 激 是 导 致 失 眠的 重 要原因, 其 病 理 生 理 基 础 是 下 丘 脑-垂 体-肾 上 腺 轴(HPA轴) 过于兴奋和亢进,orexin 是一种兴奋性神经肽激素,有强大的促觉醒效果,在维持觉醒状态中起着关键作用,HPA轴通路分泌的促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH)、 促肾上腺皮质激素(ACTH) 对于应激和觉醒状态维持也具有重要意义［2-5］。 目前, 由 于 中 医 药 治 疗 疾 病 辨 证 论 治 的 特色,缺乏中医症候动物模型给研究者带来了巨大的难题。 本实验拟采取多因素共同作用制作 “心肾不交” 所致 HPA轴紊乱的动物模型, 并对其进行评价,以期为后续研究提供合理科学的研究对象。

1 材料

1.1 动物 健康 SD大鼠窝 鼠 (出生 2 d)3 窝,每窝8只,雌雄不限,由广州中医药大学实验动物中心提供, 合格证号:SCXK(粤)2013-0020。 大鼠饲养环境为温度 (20 ±2) ℃, 相对湿度 50% ～70%, 自然光节律。

1.2 药物与试剂 对氯苯丙氨酸 (PCPA, 美国sigma公司)； ACTH、 orexin、 CRH 酶 联 免 疫 试 剂盒 (R&B公司,U.S.A), 其他试剂均为分析纯。

1.3 仪 器 酶 标 仪 (MK3 型,Thermo Labsystem公司)； 微量有机分析专用超纯水机 (伊洋企业发展有限公司)； 大鼠自主活动测试仪 (成都泰盟科技有限公司)； 全自动无创血压测量系统 BP-100A (成都泰盟科技有限公司)；Anke TGL-16B离心机；JK5200B超声波清洗器； 分析天平等。

2 方法

2.1 失眠 动 物 模型的制 作［6-7］将 出生 2 d 的 3 窝乳鼠按窝分成两组,正常组1窝8只,模型组2窝16只, 与母鼠同笼饲养。 模型组第 3 天开始乳鼠与母鼠 每 天分离 180 min, 至 第 21 天 离乳； 第 22天至第35天, 每天对乳鼠随机给予刺激: 四肢束缚 2 h、4 ℃ 冰 水 游 泳 5 min、 禁 食 24 h、 禁 水24 h、 夹 尾 1 min、 明 暗 颠 倒 24 h、 电 击 足 底10 min(电 流 强 度 1 mA, 电 压 30 V, 每 隔 10 s刺激 1 次, 每 次持续 1 s, 共 60 次)、 鼠笼倾斜 45° 24 h、 潮湿垫料 24 h 等 10 种 刺 激 随机 不 连 续 地 刺激,每天1种,每种刺激平均出现1～2次,使动物不能预料刺激的发生； 第 35 ～37 天, 每天上午8∶00—8∶30 按 10 mL/kg用 量 腹 腔 注 射 PCPA液。正常组小鼠前 35 d 不做任何处理, 第 35 ～37 天同时间等量腹腔注射弱碱性生理盐水 (pH 7 ～8)。

2.2 模型的评价

2.2.1 大鼠一般行为学 通过摄像头观察睡眠时间,正常状态下观察活动量、精神状况、双目、口唇、 爪甲、 皮毛等。 第 37天观察比较各组大鼠的体表特征, 并 进 行 体 表 特 征 积 分 评 分［7］。 评 分 标准:①精神状态及对外界的刺激反应；②眼睛眼裂变窄,嗜睡等；③面部、口鼻黏膜和爪；④食欲、体质量和消瘦程度；⑤皮毛毛色和光泽。按照5个等级进行积分,状态好的5分,状态差为1分,共计25分。 将大鼠放入自主活动仪中, 待小鼠适应5 min后, 计 数 并 打 印 3 min 内 站 立 次 数, 连 续 2次,取平均值进行统计分析。

2.2.2 血象 分别于 21、 35、 37 d 将大鼠抓取固定,充分暴露胸部,眼科剪去毛,常规消毒,以4号针头注射器选取心搏最强处进针,调整进针深浅,缓慢抽动注射器,取少许血液,进行血象检查。

2.2.3 心率和收缩压 大鼠在安静清醒状态下,放置在自 制 透明玻 璃 盒 (12 cm×5 cm×7 cm, 大鼠可前后活动,不能转身)中,日光灯照射尾部加温,用全自动无创血压测量系统测量大鼠尾动脉血压, 第 21、 第 35、第 37 天每只大鼠平行测定 3次,读取收缩压和取心率。

2.2.4 血 浆 ACTH、 orexin、 CRH的 检 测 第 37天抓取正常组和模型组大鼠各8只,眼眶静脉丛采血 3 ～4 次, 收 集 静 脉 血 4 mL,3 000 r/min 离 心5 min, 取 上 清 液, 采 用 酶 联 免 疫 吸 附 法 按 照ELISA试剂盒说明书检测 ACTH、 orexin、 CRH的水平。

2.3 数据处理 与分析 采 用 SPSS 13.0 统计软件进行数据的处理和分析,计数资料均采用均数±标准差() 表示, 组间比较采用 t检验, 以 P＜0.05 为有显著性统计学差异, 以 P＜0.01 为有极显著性差异。

3 结果

3.1 大鼠一般行为学 造模开始前各组动物均睡眠良好,精神状态,目光有神,双目、口唇呈粉红色, 爪甲光滑, 皮毛润泽, 呈白色。模型 组 37 d,动物在睡眠剥夺早期表现为一定的兴奋性行为,如活动增多,对外界声、光等刺激敏感；睡眠剥夺中后期行为由兴奋逐渐转为抑制状态,多数动物目光呆滞,双目、口唇呈苍白色,爪甲较光滑,皮毛重度枯槁蓬乱,抓取时反抗剧烈。其体表特征和自主活动情况观察结果见表1。

表1 大鼠一般行为学特征变化分析 （， n=8）Tab.1 Behavioral characteristics change analysis of insomnic rats（， n=8）

表1 大鼠一般行为学特征变化分析 （， n=8）Tab.1 Behavioral characteristics change analysis of insomnic rats（， n=8）

注: 与正常对照组比较,*P＜0.01

内大鼠活动次数 大鼠体表特征评分正常对照组组 别 3min 7.10 ±1.524 24.50 ±0.527模型对照组 31.13 ±3.441* 14.63 ±1.188*

3.2 血象检查结果 结果见表 2, 在第 22 天时外周血红细胞总数和血红蛋白水平模型组与正常组无显著性差异, 但数值略有降低；在第35天时模型组与正常组的外周血红细胞总数和血红蛋白水平有显著性差异, 模型组显著低于正常组； 在第 37 天时,模型组与正常组的外周血红细胞总数和血红蛋白水平有极显著性差异,模型组极显著低于正常组。

表2 不同阶段大鼠血象检查结果 （， n=8）Tab.2 Blood picture test results of insom nic rats at d ifferent stages（， n=8）

表2 不同阶段大鼠血象检查结果 （， n=8）Tab.2 Blood picture test results of insom nic rats at d ifferent stages（， n=8）

注: 与正常对照组相较,*P＜0.05,**P＜0.01

组别 红细胞总数 /( ×1012.L-1血红蛋白 /(g.L-1)第22 天 第 35 天 第 37 天 第22 天 第35 天 第37天) 8.52 ±1.38 8.47 ±1.52 8.54 ±1.08 134.52 ±3.67 136.18 ±4.04 142.43 ±3.12模型组 8.31 ±0.98 7.23 ±1.05* 4.57 ±1.36** 129.61 ±2.72 110.31 ±1.75** 89.45 ±2.37正常组**

3.3 大鼠尾血压值及心率的变化 结果见表 3,在第22天时模型组与正常组大鼠收缩压无显著性差异,但数值略有升高,而心率有显著性差异；在第35天时模型组与正常组的收缩压有显著性差异,心率有极显著性差异； 在第 37天时, 模型组与正常组的收缩压和心率均有极显著性差异,模型组显著高于正常组。

表3 不 同 阶段大鼠 尾 血压值及 心 率变化结 果 （， n=8） （1 mmHg=0.133 kPa）Tab.3 Blood pressure and heart rate changes of insomnic rats at different stages（， n=8）

表3 不 同 阶段大鼠 尾 血压值及 心 率变化结 果 （， n=8） （1 mmHg=0.133 kPa）Tab.3 Blood pressure and heart rate changes of insomnic rats at different stages（， n=8）

注: 与正常对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01

组别 收缩压/mmHg心率 /(次.min-1)第22 天 第 35 天 第 37 天 第22 天 第35 天 第37天正常组114.72 ±19.68 115.97 ±12.56 117.36 ±11.22 381.32 ±33.51 389.27 ±41.37 382.62 ±37.19模型组 128.51 ±12.18* 131.29 ±13.11* 144.82 ±9.59** 389.92 ±42.72* 412.31 ±52.39** 428.67 ±22.42**

3.4 血 浆 ACTH、 orexin、 CRH水 平 结 果 见 表4, 由表可见, 模型组大鼠血浆中 ATCH、 CRH和orexin 水 平 较 正 常 组 大 鼠 极 显 著 性 升 高 (P＜0.01)。

表 4 两 组 大 鼠 血 浆 ATCH、 orexin和 CRH 水 平 分 析（， n=8）Tab.4 ACTH， orexin and CRH in blood betw een the tw o groups（， n=8）

表 4 两 组 大 鼠 血 浆 ATCH、 orexin和 CRH 水 平 分 析（， n=8）Tab.4 ACTH， orexin and CRH in blood betw een the tw o groups（， n=8）

注: 与正常对照组比较,**P＜0.01

组别 ATCH /(ng.L-1) CRH /(ng.mL-1) orexin /( ×10-3.ng.mL-1) 543.65 ±23.92 16.92 ±2.17 22.66 ±5.72模型组 973.68 ±79.82**31.08 ±1.78** 32.73 ±13.02正常组**

4 讨论

现代研究表明,儿童受虐待是一个常见的可能导致个体在成人期易患失眠症的早期应激,该个体伴有持续的 HPA系统活性增强及皮质醇的响应性增加［8-9］。 本研 究 中 采 取 母 婴 分 离 方 法 造 成 幼 儿 期的早期应激,发现其对大鼠一般行为学及血象无明显影响,但显著性增加大鼠的收缩压、加速心脏搏动,表明母婴分离操作可能会导致大鼠心气虚的症状。

在导致失眠的环境危险因素中,有一大部分与HPA轴亢进有关, 而环境应激所致心理层面反应以及生理层面的 HPA轴内分泌紊乱是主要原因［10-11］。 本研究 对 HPA轴 中 ATCH、 CRH 的 水 平进 行 了 考 察, 发 现 模 型 组 大 鼠 血 浆 中 orexin、ACTH和 CRH的水平较正常组大鼠极显著性升高,提示通过多因素刺激可以导致 HPA轴激活, 使CRH、 ACTH合成和分泌增多, 而这些激素分泌量的增加可促使大脑皮质或脑干神经元觉醒,可能是orexin 促进觉醒的机制之一。

对氯苯丙氨酸是一种 5-HT合成抑制剂, 运用PCPA腹腔注射大鼠可以抑制大鼠大脑 5-HT合成,造成 昼 夜 节 律 小 时, 几 乎 达 到 完 全 失 眠［12-13］。 现代研究表明,PCPA诱导的动物模型属于中医心肾不交的症候模型［14］。 本研 究 在 中 医 心 肾 不 交 理 论的指导下,采取多因素共同作用制作失眠大鼠模型时也出现了 HPA轴内分泌紊乱的特点, 表明该模型能满足 HPA轴紊乱的相关机制和给药研究的需要。

综上所述,在早期母婴分离的基础上,采用多种物理刺激法结合腹腔注射 PCPA剥夺睡眠法制作 HPA轴紊乱的失眠大鼠模型, 较成功的模拟出失眠的相关症候,这为探索失眠发生发展机制奠定了重要基础,也为治疗失眠的中药新药开发提供了更加科学合理的动物模型。但本研究缺乏对该失眠动物模型进行药物反证,尚有待进一步研究和探讨。

［1］ 失眠定义、 诊断及药物治疗共识专家组.失眠定义、 诊断及药物治疗专家 共识 (草 案) ［ J］.中 华 神经 科杂 志, 2006,39(2):141-143.

［ 2 ］ Gerashchenko D,KohlsM D,Greco M,etal.Hypocretin-2 saporin lesionsof the lateralhypothalamus producenarcoleptie-like sleep behavior in the rat［ J］ .J Neurosci,2001,21(18): 7273-7283.

［3］ 窦锡彬,张红参,李克明,等.壮医药线点灸联合针刺对失眠 患者 血浆 Orexin 及 HPA轴 的影响 ［ J］ .右 江 民 族 医 学院学报,2013,35(1):9-11.

［4］ 李一瀛,胡珍真,黄志力,等.应激在抑郁症失眠中的作用和常用应激动物模型的睡眠特点［J］.药学学报,2012, 47(1):1-6.

［5］ 黎发根,李绍旦,杨明会,等.和胃安神方对失眠大鼠血浆及下丘脑食欲素 A的影响［J］.环球中医药,2012,5 (11):801-803.

［ 6 ］ W illner P.Validity,reliability and utility of the chronic mild stressmodel of depression:a10-year review and evaluation［ J］. Psychopharmacology,1997,4(134):319-329.

［7］ 高希言, 马巧琳, 胡 斌.针刺 “四神聪” 对睡眠紊乱模型小鼠 生 理 功 能 的 影 响 ［ J］.中国针灸,2007,27(9): 681-683.

［ 8 ］ Gorgulu Y,Caliyurt O.Rapid antidepressant effects of sleep deprivation therapy correlates with serum BDNF changes in major depression［ J］ .Brain Res Bull,2009,3(80):158-162.

［ 9 ］ Benca R M,Peterson M J.Insomnia and depression［ J］ .Sleep Med,2008,9(Suppl 1):S3-9.

［10］ Nutt D,Wilson S,Paterson L.Sleep disorders as core symptoms of depression ［ J］ .Dialogues Clin Neurosci,2008,10 (3):329-336.

［11］ 毛昌淳, 方肇勤, 吴敦序, 等.补肾定喘汤对哮喘大鼠血CORT、 下丘 脑 CRH mRNA表 达 的 影 响 ［J］.中 成 药, 2003,25(6):468-470.

［12］ 许小伍.基于线粒体途径探讨安寐汤抑制大鼠皮质神经元兴奋机制 ［D］.广州: 广州中医药大学,2013.

［13］ Zhou Y L,Gao X Y,Wang PY,etal.Effectof acupuncture at different acupoints on expression of hypothalamic GABA and GABA(A)receptor proteins in insomnia rats［ J］.Zhen Ci Yan Jiu,2012,37(4):302-307.

［14］ 全世建, 林杏娥, 刘 妮.PCPA大鼠失眠模型的症候属性研究［J］.中医药学刊,2006,24(3):450-451.

Ratmodel for insomnia caused by heart-kidney imbalance

GAO Hong-li1, TU Xing2, LU Ying2, SUN Min-hong3, ZHANG Fang4

(1.Institute of Traditional ChineseMedicine,Hubei Institute for Nationalities,Enshi445000,China； 2.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China； 3.The Enshi Center for Disease Control and Prevention,Enshi 445000,China； 4.Special Care Hospital of Enshi,Enshi445000,China)

AIM To establish a ratmodel for insomnia that was consistentwith both heart-kidney imbalance and disorder of hypothalamic-pituitary-adrenal(HPA)axis.METHODS Maternal separation,multiple anxiety stimulation,and the abdominal administration of chlorophenylalamine were adopted to induce rats with insomnia. The general behavior of rats was observed and their hemogram and the levels of ACTH,orexin,CRH were measured.RESULTS Compared to the control group,the rats in the model group showed sleep-less,glassy-eyed, pale lips,and withered fur.The number of red blood cells and the hemoglobin concentration in plasma decreased significantly aswell,while the level of ACTH,orexin and CRH significantly increased.CONCLUSION The insomnia rats can present the symptom of heart-kidney imbalance and dysfunction of hypothalamic-pituitary-adrenal axis.

insomnia；heart-kidney imbalance；hypothalamic-pituitary-adrenal(HPA)axis； animalmodel；hormone secretion

R285.5

:A

:1001-1528(2014)06-1138-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.006

2013-10-12

郜红利 (1967—), 男, 副教授, 研究方向: 民族药物的开发与利用。 E-mail:349523825@qq.com

*通信作者: 涂 星 (1987—), 男, 博士生, 研究方向: 中药药理学, 药物制剂新剂型与新技术。 E-mail:kuangsheng1234@126.com