齐墩果酸生物黏附胶囊的制备及其释药特征

牟景丽， 何 峰，2， 黄 勇，2， 刘丽君， 郑 林，2*

（1.贵阳医学院药学院， 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州省药物制剂重点实验室， 贵州 贵阳 550004）

齐墩果酸生物黏附胶囊的制备及其释药特征

牟景丽1， 何 峰1，2， 黄 勇1，2， 刘丽君1， 郑 林1，2*

（1.贵阳医学院药学院， 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州省药物制剂重点实验室， 贵州 贵阳 550004）

目的 制备齐墩果酸生物黏附胶囊并研究其释药特征。方法 采用单因素正交设计法,确定羟丙甲基纤维素K4M、 卡波姆 971PNF、 乳糖的用量及配比与制剂体外释放度及黏附力的关系。 以齐墩果酸生物黏附胶囊在大鼠胃黏膜滞留率考察其生物利用度,并对其释药过程进行动力学方程拟合以判断释药机制。结果 实验表明羟丙甲基纤维素与卡波姆均能阻滞药物的释放和对胃肠组织有较大的黏附力。 生物黏附胶囊释药以 Higuchi方程拟合最佳, 与 Peppas方程也有较好的相关性。结论 该处方设计及制备工艺合理。其释药特征说明扩散和溶蚀均起作用,但扩散机制所占的比例相对较大。

齐墩果酸； 卡波姆 971PNF； 羟丙甲基纤维素 K4M； 生物黏附胶囊； 释放度

齐墩果酸 (oleanolic acid,OA) 为五环三萜类化合物,广泛存在于食物和植物中。齐墩果酸可以降转氨酶,对急性肝损伤有明显的保护作用,促进肝细胞再生,防止肝脏病变；临床所用的齐墩果酸制剂为治疗黄疸型肝炎、慢性迁移性肝炎及慢性活动性肝炎的齐墩果酸片剂和胶囊剂［1-2］。

胃肠道生物黏附制剂［3-5］是近年来研究较 多的新型给药系统,它不仅能延长药物制剂在胃肠道的滞留时间,还能增加药物与吸收黏膜的接触,改变细胞膜的流动性,增加药物对小肠上皮细胞的穿透力。因而可以促进药物吸收,提高生物利用度［6-7］。 齐墩果酸 为 难 溶 性 药 物, 水 溶 性 较 低, 在胃肠道内停留时间短,也不利于药物充分吸收。为了延长齐墩果酸在胃肠道内的停留时间,增加在体内的吸收,从而达到缓、控释给药,减少给药次数的目的。因此,本研究利用生物黏附技术,将其制成生物黏附胶囊,以期增加其胃肠道内的停留时间, 提高其生物利用度［8］。

1 仪器与材料

齐墩果酸对照品 (中国食品药品检定研究院,纯度≥98%, 批号 110709-200505)； 齐墩果酸原料药 (长 沙 九 芝 堂 制 药 厂, 纯 度 ≥95.1%, 批 号20040306)； 羟丙甲基纤维素 (HPMC, 规格 K4M、K15M、 K100M) 和 卡 波 姆 ( 型 号 CP974PNF和CP971PNF)( 上海 Colorcon 公司)； 药用乳糖、聚乙烯比咯烷酮 (PVP)K30(上海运宏化工辅料制剂技术有限公司)。

Prominence LC-20A型 高 效 液 相 色 谱 仪、 UV-2401PC型紫外分光光度计 (日本岛津公司)；ZB-2 型崩解仪、 RC806 型智能溶出仪 (天津市天大天发科技有限公司)； 黏附力测定装置 (自制)。

SD大鼠 ［250 g, 雌雄不限, 贵阳医学院实验动物中心, 批号 SCXK(黔)2002-0001］。

2 方法与结果

2.1 测定方法

2.1.1 最大波长的选择 精密称取齐墩果酸对照品10 mg, 并配 制 为 1 mg/mL的 甲 醇 溶 液 ；精 密 吸取 0.3 mL于 10 mL量 瓶 中, 用 0.5%十 二 烷 基 硫酸钠 (以下简称 SDS) 溶液定容, 即得对照品溶液。 以 0.5%SDS 溶 液 为 空 白 对 照, 在 190 ～500 nm范围内进行紫外扫描。 结果表明齐墩果酸在 205 nm处有最大吸收。

2.1.2 色 谱 条 件 Onyx Monolithic C18色 谱 柱(4.6 mm×100 mm)； 流 动 相 乙 腈 -0.5%乙 酸 溶液 (80 ∶20)； 体 积 流 量 1 mL/min； 检 测 波 长205 nm, 柱温 35 ℃, 进样量 10 μL。

2.1.3 标准曲线的制备 精密量取标准贮备液0.01、 0.05、 0.15、 0.25、 0.25、 0.45 m L 于10 mL量瓶中, 按 “2.1.1” 项下操作, 配制成质量浓度为 1、5、 15、25、35、45 μg/mL的标准供试液,10 μL进样。 以溶液质量浓度 (μg/mL) 为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归方程:A= 30 544 978.5C-2 948.4(r=0.999 3), 线 性 范 围为 1 ～45 μg/mL。

2.1.4 精密度考察 取 “标准曲线的制备” 项下低、中、高3个质量浓度的溶液,于高效液相色谱仪测定其吸收度 A,24 h 内重复测定 5 次, 计算日内精密度；连续测定5 d计算日间精密度,结果表明: 该方法的日内、 日间精密度 RSD＜3%(n= 5), 表明日内、 日间精密度良好, 符合要求。

2.1.5 回收率试验 按标示量的 80%、100%、120%精密称取齐墩果酸及其辅料的混合物, 按“2.1.1” 项下操作, 配制成适当浓度的 0.5%SDS溶液, 取续滤液 10 μL进样, 以测得量与加入量相比较, 计算回收率及 RSD, 平均回收率在 98.6% ～100.6%之间,RSD＜3%(n=9), 符合要求。

2.1.6 稳定性试验 精密称取生物黏附细粉, 按“2.1.1” 项 下 操 作, 配 制 成 30 mg/m L的 0.5% SDS 溶液, 置 37 ℃水浴中, 分别在 0、 1、2、 4、6、 8、10、 12 h 取 样,10 L进 样 。 所 测 峰 面 积 的RSD为 1.12%(n=8), 表 明 齐 墩 果 酸 的 0.5% SDS 溶液在 12 h 内稳定。

2.2 齐墩果酸生物黏附胶囊的制备

2.2.1 制备工艺 按处方量称取齐墩果酸原料药及各种辅料, 过 80 目筛并充分混匀, 用含 8% PVP K30 的 95%乙 醇 溶 液 制 软 材,20 目 筛 制 粒, 50 ℃下烘干2 h,20 目筛整粒, 装入1 号胶囊, 即得生物黏附胶囊, 每片含齐墩果酸30 mg。

2.2.2 处方筛选与优化 采用单因素法, 保持主药齐墩果酸用量为30 mg不变, 考察辅料包括黏附材料、骨架材料、填充剂 (乳糖) 的种类及用量对齐墩果酸生物黏附缓释胶囊释放度和黏附力的影响,从而确定胶囊的最优处方。且释放度均用相似因子法进行评价［9］。

2.3 体外释放度的测定 采用中国药典 2010 版第二部附录X C第一法装置 (篮 法), 以 脱 气 0.5%十二烷 基 硫酸钠 (SDS) 溶 液 900 m L为 溶 出 介 质,转 速 为 100 r/min, 温度 37.5 ℃, 分 别 于 1、 2、 4、6、 8、10、 12 h 取 样 5 mL, 同 时 补 充 同 温 等 量 介质 5 mL, 用0.45 μm微孔滤膜过滤, 弃去初滤液,续滤液10 μL进行高效液相色谱法测定。

2.4 生物黏附 胶 囊 体 外 黏 附 力 评 价［10-13］大 鼠 黏膜组织制备: 实验前动物禁食不禁水12 h, 取出胃和小肠,纵向剖开,用磷酸盐缓冲液冲去内容物,将其固定于纵向切开的聚乙烯管上。

实验装置图见文献［12］ 报道。 分别选取 20 目粒径范围的黏附颗粒 100 粒, 均匀铺撒在小肠或胃黏膜上。 将聚乙烯管倾斜 60℃, 置盛有饱和硝酸钾溶液的干 燥 器 (RH=92.5%) 内, 放置 20 min,使颗粒充分水化并与小肠胃黏膜发生相互作用。然后将聚乙烯管倾斜度 45℃, 用蠕动泵控制磷酸盐缓冲液流速由上至下进行淋洗,淋洗流速为40 mL/min, 记录滞留于 大鼠小肠或胃黏膜 上的颗粒数,计算颗粒在肠或胃黏膜上的滞留率。

滞留率%=淋洗后颗粒数/100 ×100%

2.5 单因素考察 以辅料的型号、 用量设计各处方,并按下表各处方顺序进行单因素考察,筛选出各辅料的型号和最佳用量, 各处方组成见表1。

表1 单因素考察Tab.1 Single factor exp loration

以各处方 2、 6、 12 h 的累积释放 度 Q值及黏附力为评价指标,结果各辅料型号、用量分别为HPMC K4M 48 mg、 CP971PNF 9 mg、 乳 糖 用 量10 mg时较好。 结果如表 2 ～3 所示。

表2 单因素考察结果Tab.2 Results of single factor exp loration

表3 单因素相似因子考察结果Tab.3 Sim ilarity factor of single factor exploration

2.6 正交设计

2.6.1 因素水平的确定 根据单因素试验结果,以 HPMC用量、 乳糖用 量、 乳 糖 用 量 为 3 因 素,各安排3水平进行正交, 见表4。

表4 因素水平Tab.4 Factors and levels of orthogonal test

2.6.2 正 交 设 计 处 理 方 法［9］为 兼 顾 各 项 指 标,采用综合加权评分法,将两指标转化为单一指标。两个单项指标的获得方法如下:

①释放度指标 f1按 A=(R2+R6+R12)/3计算,式中A为溶出度评价参数,凡为2 h的累百分率评价分数,2 h 累积溶出 20%计为 100 分, 每增加或减少 1%则减 2 分,6 h 累积溶 出 60%计为100 分, 每增加 或 减少 1%则减 2 分,R12为 12 h 的累积溶出百 分率的 评价分数,12 h 累积溶 出 90%计为100 分每增加 1%加2 分, 每减少 1%减 2 分。Amax为测得的最大值, 归一化后释放度指标为

各处方释放度指标、黏附力指标和综合指标计算结果见表 5, 方差分析见表 6。

表5 正交设计及结果Tab.5 Results of orthogonal test

表6 方差分析结果Tab.6 Result of ANOVA

一致性子集表结果见表7。

表7 综合指标一致性子集Tab.7 Consistent subset table of capsu les

通过方差分析及一致性子集表分析,A、 B、C三因素中A、B因素具有显著性差异,在所选因素范围内,CP971PNF、 HPMCK4M、 乳糖不同用量,各因素作用主次顺序为 B＞A＞C, 其最佳工艺条件为 A3B2C2。

2.7 释药机制的探讨 按照最优处方制备 3 批齐墩果酸黏附胶囊,进行释放度试验。将3批生物黏附胶囊 R t的平 均 值 -t曲线 (R t-t曲线) 分别 以 零级、 一级、 Higuchi、 Peppas方 程 进 行 拟 合, 并 按Peppas方程计算释放参数以判断释药机制。 3 批齐墩果酸生物黏附胶囊的释放度和黏附力结果如图1、 图 2 所示。 R t-t曲线 (见图 1) 的零级、 一级、Higuchi以及 Peppas方程见表 8。

图 1 3 批齐墩 果 酸 生物黏附 胶 囊的 R t-t曲线Fig.1 Curve of oleanolic acid bioadhesive-coated capsules in three batches dissolution

图2 3批齐墩果酸生物黏附胶囊的黏附力Fig.2 Adhesive force of oleanolic acid bioadhesive-coated capsules in three batches

表8 拟合的释药方程Tab.8 Analysis of release data from bioadhesive-coated capsules using different equations

结果表明, 黏附胶囊释放曲线用 Higuchi释放方程拟合相关性较高,表明黏附胶囊的释放机制以扩散为主。 经 Peppas方程拟合也有较好的相关性。根 据 Peppas方 程:Mt/M∞=knt, 即 In Mt/M∞= n lnt+Ink, 式 中 Mt/M∞为 药物在某一 时 刻的累积释放百分数,t为时间,k为释放常数,n为释放参数, 该参数是 PePpas方程中表征释放机制的特征参数, 计算结果表明 n=0.83( ＜0.89), 表明释放时,扩散和溶蚀均起作用,扩散机制所占的比例相对较大。

4 讨论

4.1 随着 CP971 用量的增加, 释放度相应减少,这是因为当处方中含有较多的 CP971 时, 药物释放过程中形成了微凝胶团,药物被包裹在微凝胶团中,需通过微凝胶团扩散和凝胶团的溶蚀而释放,使得药物在检测的时间内完全释放比较困难,因此释放速 度 可 能 很 缓 慢［13］。 HPMC水 化 形 凝 胶 层,控制药物的释放速度。因此在方差分析中, HPMC、 CP对药物的释放有显著性影响。 目标制剂中释放度和黏附性均为重点,因此正交设计中以释放度和黏附力结合获得综合指标, 以 SPSS 统计学软件进行方差分析,得到优化处方的参数,并通过验证获得符合要求的制剂。

4.2 生物黏附性能的体外评价方法有测定最小剥离力、 组织留存率 Rargas法等。黏附力测试预实验中曾采用文献 报 道 的 黏 附 力 测 试 装 置［11］, 发 现肠黏膜容易从薄片上脱落。本实验对黏附力测定装置进行改良,通过自制的冲洗槽,将胶囊颗粒均匀铺在胃黏膜上,用很低流速冲洗黏附颗粒,计数冲洗颗粒,所用测量方法重现性良好,能用于胃肠道生物黏附制剂的处方筛选。制备的齐墩果酸生物黏附胶囊对胃肠组织有较大的黏附力［12］。

4.3 通过对不同释药方程的拟合, 显示优化后的处方释药机制符合 Higuchi释放, 表明生物黏附胶囊的释放机制以溶蚀扩散为主。 同时经 Peppas方程拟合也有较好的相关性,显示此制剂中药物的释放机制为扩散和骨架溶蚀的协同作用,这可能是因为在释放初期,药物释放速度主要依赖于颗粒接触介质的表面积以及颗粒周围介质的浓度梯度而导致药物的快速释放［14］, 从而以扩散为主的释放机制,随着药物释放的进行,HPMC逐渐形成凝胶层, 逐开始溶蚀,药物随着骨架结构的溶蚀开始缓缓释出,此时药物的释放机制既有架溶蚀,又有扩散。

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Preparation of oleanolic acid bio-adhesive-coated capsule and their release characteristics

MU Jing-li1, HE Feng1,2, HUANG Yong1,2, LIU Li-Jun1, ZHENG Lin1,2*

(1.School of Pharmacy,Guiyang Medical College,Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicines and TCM, Ministry of Education,Guiyang 550004,China； 2.Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics in Guizhou Province,Guiyang 550004,China)

oleanolic acid； carbopol 971PNF； hypromellose； bioadhesive releasing rate

R944

:A

:1001-1528(2014)06-1186-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.016

2013-07-14

贵州省社会发展攻关计划课题 (黔科合 SY ［2013］ 3057 号)； 贵阳市科技计划项目 ( 筑科合同 ［2013204］ 4-3 号)； 贵州省中药现代化科技产业 (黔科合中药字 ［2011］ 5081 号)。

牟景丽 (1987—), 女, 硕士生, 从事药物新剂型及药代动力学研究。 Tel:(0851)6908468,E-mail:chanli@126.com

*通信作者: 郑 林 (1981—), 女, 硕士, 副教授, 从事天然药物活性物质基础及药代动力学研究。 Tel:(0851)6908468,E-mail: mailofzl@126.com