慢性睡眠限制对幼鼠空间学习记忆能力的影响

刘 艳，吴卫平

解放军总医院 南楼神经内科，北京 100853

慢性睡眠限制对幼鼠空间学习记忆能力的影响

刘 艳，吴卫平

解放军总医院 南楼神经内科，北京 100853

目的探讨慢性睡眠限制对幼鼠空间学习记忆能力的影响。方法将24只1月龄SD雄性鼠随机分为慢性睡眠限制组、睡眠剥夺组和对照组，每组8只。对慢性睡眠限制组幼鼠进行连续5 d每天6 h的睡眠限制，采用“温和处理法”；对睡眠剥夺组幼鼠进行连续5 d每天6 h的睡眠剥夺，采用“多平台水环境法”。分别在睡眠干预前和干预第1、3、5天应用Morris水迷宫方法检测幼鼠的空间学习记忆能力。结果水迷宫实验显示睡眠限制组、睡眠剥夺组幼鼠在睡眠干预的第3天、第5天，到达平台的平均潜伏期、探索路程较对照组延长(P＜0.05)，其中睡眠剥夺组在第5天的影响最显著(P＜0.01)；在睡眠干预的第5天，睡眠限制组、睡眠剥夺组幼鼠之间出现了差别，睡眠剥夺组幼鼠的潜伏期、探索路程较睡眠限制组延长(P＜0.05)；而在空间探测实验中，3组幼鼠在平台所在象限时间的百分比、穿环次数有显著差异：睡眠剥夺组较睡眠限制组减少(P＜0.05)，较对照组显著减少(P＜0.01)；睡眠限制组较对照组减少(P＜0.05)。结论连续5 d、每天6 h的慢性睡眠限制可减弱幼鼠的空间学习记忆能力，但其影响程度小于同等时间的睡眠剥夺。

慢性睡眠限制；睡眠剥夺；学习记忆；幼鼠

睡眠是维持人类许多生理功能稳态所必需的，睡眠对记忆的形成、存储等都具有重要作用[1-2]。睡眠不足可引起学习记忆的损害，这一点已有广泛的研究证实[3-6]。但目前国内此类研究，主要集中于快速眼球运动(rapid eyes movement，REM)睡眠的剥夺，对慢性睡眠限制(chronic sleep restriction，CSR)的研究较少。许志强等[7]曾报道慢性睡眠限制可对成年大鼠的空间学习记忆能力造成损伤，但国内未见到慢性睡眠限制对未成年幼鼠影响的相关报道。Yang等[8]通过“轻触法”对未成年幼鼠实施每日4 h、连续7 d的CSR，结果导致幼鼠的空间学习记忆能力受损；但该研究未将REM睡眠剥夺与慢性睡眠限制两种睡眠干预模型进行比较。CSR采用较温和的方式在每天特定时间段限制睡眠，连续数天，与传统睡眠剥夺方式相比，CSR对研究对象产生的额外应激压力更小[9]。为进一步探讨二者作用异同，我们分别对未成年鼠进行了两组睡眠干预方式，并比较了其学习记忆能力的差异。现报道如下。

材料和方法

1 动物及分组 选用健康雄性1月龄SD鼠24只，置22℃室温下，12 h明暗交替光照环境(光照周期7：00 - 19：00)，自由饮水、进食。将24只幼鼠随机分为慢性睡眠限制组、睡眠剥夺组(sleep deprivation，SD)和对照组，每组各8只。

2 睡眠干预措施 对慢性睡眠限制组幼鼠进行连续5 d每天6 h的睡眠限制方案，时间为7：00 -13：00，剥夺方法采用“温和处理法”：当发现幼鼠有睡眠行为出现时，通过轻敲或晃动饲养笼、将幼鼠从笼子中移出等方法来阻止幼鼠睡眠行为的发生[9]。每天剩余时间即从当日13：00至次日晨7：00，幼鼠可有充分的睡眠时间。对睡眠剥夺组幼鼠进行连续5 d每天6 h的睡眠剥夺方案，采用“多平台水环境法”制作大鼠REM睡眠剥夺模型：睡眠剥夺箱大小为150 cm×30 cm×30 cm，放置直径为4.5 cm、高8 cm的平台8只。剥夺箱内注有水，水面低于平台2 cm，水温保持在(20±2)℃。大鼠可以在平台上自由摄取食物和水，但当进入睡眠时，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而惊醒，造成REM睡眠剥夺。剥夺时间段等其他情况同睡眠限制组。对照组幼鼠不采取任何睡眠干预措施。

3 学习记忆能力测试 采用Morris水迷宫测量幼鼠的学习和记忆能力[10]。Morris水迷宫直径150 cm，高50 cm，水深30 cm，水温22℃。玻璃平台位于固定于东北象限中央，直径10 cm，高29 cm。用墨水将水染黑。实验分为定位航行实验和空间探测实验两个部分：1)定位航行实验：分别在睡眠干预前和睡眠干预第1、3、5天进行4次测试，每次测试时将幼鼠从东、南、西、北4个入水点放入水中，入水时面向池壁。每只幼鼠在各个入水点进行两个轮次测试。测试时每只幼鼠有120 s时间寻找站台，找到站台后，允许其在站台上呆30 s，然后开始同一入水点第二轮次的测试。如果120 s内没有找到站台，那就把幼鼠引到站台上放置30 s。观察并记录幼鼠找到并爬上平台的潜伏期、探索路程。2)空间探测实验：在第5天睡眠干预完成并进行完定位航行实验后，撤除水下平台，将幼鼠从最后一次入水点面向池壁放入水中，使幼鼠在水迷宫中连续游泳，记录其在90 s内在平台所在象限时间的百分比和穿越原平台所在地的次数。

4 统计学分析 应用SPSS13.0统计学软件进行处理，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。

结 果

1 Morris水迷宫定位航行实验 在定位航行实验的检测中，睡眠干预前、干预的第1天各个入水点两轮次的平均潜伏期在CSR组、SD组和对照组差异无统计学意义，其对应的平均路程在3组间差异也无统计学意义(P＞0.05)；睡眠干预的第3天、第5天，在各个入水点两轮次检测中，CSR组、SD组幼鼠到达平台的平均潜伏期较对照组明显延长，平均路程明显延长(P＜0.05)；其中SD组在第5天的延长最显著(P＜0.01)；睡眠干预的第5天，SD组幼鼠到达平台的平均潜伏期、探索路程较CSR组明显延长(P＜0.05)。见表1、表2。

2 Morris水迷宫空间探测实验 3组幼鼠在平台所在象限时间的百分比、穿环次数有显著性差异，睡眠剥夺组较睡眠限制组明显减少(P＜0.05)，较对照组显著减少(P＜0.01)；睡眠限制组较对照组明显减少(P＜0.05)。见表3。

表1 定位航行实验中各组幼鼠的潜伏期(s)比较Tab. 1 Latent periods in different groups undergoing place navigation test (±s, n=8)

表1 定位航行实验中各组幼鼠的潜伏期(s)比较Tab. 1 Latent periods in different groups undergoing place navigation test (±s, n=8)

aP＜0.05, vs SD group; bP＜0.05, cP＜0.01, vs control group 1st: first training; 2nd: second training; SI: sleep intervention

CSR group (s)SD group (s)Control group (s) 1st SI 0 d76.35±9.7274.11±8.9778.29±10.01 SI 1 d54.67±7.3352.72±6.8455.09±7.81 SI 3 d38.36±4.18b39.55±6.21b33.14±5.19 SI 5 d29.28±2.23ab32.45±3.26c26.03±2.81 2nd SI 0 d67.84±8.9765.97±9.1569.33±9.84 SI 1 d45.47±5.2343.86±6.1247.11±5.35 SI 3 d28.14±2.26b29.02±3.46b24.94±3.07 SI 5 d22.34±3.13ab25.95±2.98c19.16±2.34

表2 定位航行实验中各组幼鼠的探索路程(m)比较Tab. 2 Exploring distance in different groups undergoing spatial probe test ±s, n=8)

表2 定位航行实验中各组幼鼠的探索路程(m)比较Tab. 2 Exploring distance in different groups undergoing spatial probe test ±s, n=8)

aP＜0.05, vs SD group; bP＜0.05, cP＜0.01, vs control group

CSR group (m)SD group (m)Control group (m) 1st SI 0 d12.75±4.0711.94±3.7913.43±4.36 SI 1 d10.18±2.179.47±1.4411.25±2.23 SI 3 d8.84±1.98b9.13±2.18b6.86±1.61 SI 5 d5.93±1.28ab7.82±1.76c4.51±1.12 2nd SI 0 d11.46±3.4710.88±2.9112.36±4.01 SI 1 d9.52±2.138.64±2.3410.41±3.14 SI 3 d7.86±2.01b8.57±2.21b5.77±1.69 SI 5 d4.85±1.31ab6.73±1.67c3.46±1.02

表3 各组幼鼠在平台所在象限的时间比和穿环数比较Tab. 3 TTQ and NPC in different groups (±s)

表3 各组幼鼠在平台所在象限的时间比和穿环数比较Tab. 3 TTQ and NPC in different groups (±s)

aP＜0.05, vs SD group; bP＜0.05, cP＜0.01, vs control group TTQ: time in target quadrant; NPC: numbers of platform crossing

CSR groupSD groupControl group TTQ (%)42.11±5.42ab36.46±4.47c48.35±5.69 NPC (times)5.79±1.26ab4.41±1.13c7.24±1.37

讨 论

学习与记忆是相当复杂的脑力活动，学习是神经系统接受环境的变化而获得新行为习惯的过程，记忆是学习后经验的存储和保持。Morris水迷宫定位航行实验中各个不同入水点的第1轮次的成绩反映空间分辨学习能力，第2轮次成绩和空间探测实验成绩反映记忆保持能力、工作记忆[11-12]。从结果可以看出，慢性睡眠限制组、睡眠剥夺组幼鼠在睡眠干预的第3天、第5天，都造成了幼鼠短时记忆获得能力和工作记忆的明显损伤，而睡眠剥夺的损伤更严重，睡眠限制与睡眠剥夺的作用程度区别在睡眠干预的第5天就显现了出来。无论睡眠限制还是睡眠剥夺模型，均造成了受试对象的睡眠不足，进而造成学习、记忆的损害，在这一点上，本研究的结果与其他众多相关研究的结果基本一致；而两模型的不同点在于睡眠剥夺模型更倾向于REM睡眠剥夺，同时伴有较强的应激压力刺激，而慢性睡眠限制模型相对温和。从本研究的结果也可以进一步印证，虽然CSR模型和SD模型剥夺的睡眠时间总长度一致，但其对幼鼠的学习记忆功能影响是有差别的。

本研究结果与Yang等[8]的研究结果基本相似，不同之处在于后者在CSR的第7天才造成幼鼠的记忆损害，而本研究幼鼠在CSR的第3天就出现了记忆功能损害，其原因可能在于两个研究每日睡眠限制的时间不同：Yang等干预措施为每日4 h的CSR，第7天出现阳性结果；本研究的干预措施为每日6 h的CSR，第3天就有阳性发现。这一发现提示慢性睡眠限制对幼鼠的空间学习记忆能力的影响程度可能存在量效关系。

综上所述，CSR模型和SD模型对幼鼠的空间记忆均可造成损害，在总睡眠长度相等的情况下，CSR对幼鼠的记忆影响程度小于SD；CSR对幼鼠的记忆影响程度可能存在量效依赖关系。这些发现仍有待于其他研究的进一步证实，其具体机制尚有待于进一步研究。

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7 许志强，高长越，方传勤，等.睡眠剥夺对小鼠学习记忆和海马pCREB水平的影响［J］.中华行为医学与脑科学杂志，2010，19（5）：392-393.

8 Yang SR， Sun H， Huang ZL， et al. Repeated sleep restriction in adolescent rats altered sleep patterns and impaired spatial learning/ memory ability［J］. Sleep， 2012， 35（6）： 849-859.

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11 司江华，杨金升，石向群，等.丹红注射液对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响［J］.时珍国医国药，2010，21（10）：2511-2513.

12 王嫄，陈景元，张云，等.睡眠剥夺对大鼠空间学习记忆能力的影响［J］.卫生研究，2007，36（2）：234-236.

Effect of chronic sleep restriction on spatial learning and memory in infantile rats

LIU Yan, WU Wei-ping
Department of Neurology in South Building, Chinese PLA General Hospital, Beijing100853, China
Corresponding author: WU Wei-ping. Email: wuwp@vip.sina.com

ObjectiveTo study the effect of chronic sleep restriction (CSR) on spatial learning and memory ability in infantile rats.MethodsTwenty-four male infantile SD rats at the age 1 month were randomly divided into CSR group, sleep deprivation (SD) group, and control group (8 in each group). Rats in CSR group and SD group underwent sleep restriction by gentle handing and multiple water platform techniques, respectively, 6 h a day for 5 days. Their spatial learning and memory ability were assessed by Morris water maze test before and 1, 3, 5 days after sleep intervention.ResultsMorris water maze test showed that the average latent period and distance were significantly longer in CSR group and SD group than in control group on days 3 and 5 after sleep intervention (P＜0.05), especially in SD group than in control group on day 5 after sleep intervention (P＜0.01). The latent period and distance were significantly longer in SD group than in CSR group on day 5 after sleep intervention (P＜0.05). Spatial probe test showed that the time in target quadrant (TTQ) and the number of platform crossings (NPC) were significantly lower in SD group than in CSR group and control group (P＜0.05).ConclusionCSR (6 h a day for 5 days) impairs the spatial learning and memory ability in infantile rats. However, its effect is ≤that of sleep deprivation on the spatial learning and memory ability in infantile rats.

chronic sleep restriction; sleep deprivation; learning and memory; infantile rats

R 749.71

A

2095-5227(2014)06-0620-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.06.029

2014-03-07 16:41

http://www.cnki.net/KCMS/detail/11.3275.R.20140307.1641.012.html

2013-10-24

刘艳，女，在读博士，主治医师，研究方向：神经内科。Email: neoyen3011@126.com

吴卫平，男，主任医师，博士生导师。Email: wuwp@vip. sina.com