超声造影剂对高强度聚焦超声破坏棘球蚴囊壁的增强作用

蔡 辉，赵海龙，叶 彬，刘爱波，陈露露，张 静，王梦莹

囊型包虫病(cystic echinococcosis)是由细粒棘球绦虫(echinococcosis)的幼虫寄生所引起的人兽共患病，肝脏为最易受累器官。尽管囊型包虫病的诊断和治疗技术都有了很大的发展，但该病仍在世界上许多发展中国家流行[1]。目前，手术仍为包虫病最主要的治疗方式。术中原头节的泄漏以及术后原头节和生发层的残留是引起包虫病复发的最主要原因[2]。本项目组发现高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound，HIFU)对离体棘球蚴有一定的杀伤效果[3]。且超声造影剂(ultrasound contrast agent，UCA)可增强HIFU的空化效应和热效应，从而增强HIFU对棘球蚴内原头节的杀伤效果[4]。本试验拟探索UCA协同HIFU辐照离体细粒棘球蚴后囊壁的损伤情况，了解UCA协同HIFU杀伤棘球蚴的机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器 JC型高强度聚焦超声肿瘤治疗系统由青海大学附属医院提供。

1.1.2主要试剂 超声造影剂由重庆医科大学附属第二医院超声影像学研究所提供(按照使用说明，将其用5 mL生理盐水溶解，溶解后微泡浓度约为1×109个/mL，直径3.5～4.5 μm，分布均匀)；20%多聚甲醛；2.5%戊二醛由重庆医科大学生命科学研究院电镜室提供。

1.1.3棘球蚴标本 感染棘球蚴的羊肝采自青海省西宁市某屠宰场。标本取出后立即放入冰盒并送往实验室。用生理盐水洗净羊肝表面血迹，B超检测病灶大小，选取形状为球形或近似球形、直径30 mm、囊壁较薄且弹性良好的棘球蚴作为实验材料。修整后置入生理盐水中备用。

1.2方法

1.2.1实验分组 选取15个直径为30 mm左右的包囊随机分为3组：对照组，接受超声假照；单纯HIFU组，接受100 W HIFU辐照；HIFU+UCA组，注入0.1 mL UCA后进行HIFU辐照。

HIFU参数如下：治疗扫描方式为点扫射，扫描速度3 mm/s，每个点扫描3次，每次3 s，层间距5 mm。治疗功率为100 W。治疗时间不等，由包囊大小决定。

1.2.2超声图像灰度变化 包囊的每个层面治疗结束后，肉眼观察监控图像所示灰度变化，并立即用系统自带灰度分析软件分析靶区治疗前后的灰度变化。

1.2.3包囊处理后立即剪开包囊，肉眼观察内囊变化 每个囊壁随机剪取不同部位的组织块，置入分装的2.5%戊二醛中固定留作投射电镜和扫描电镜标本。同时，每个囊壁随机取样固定于20%多聚甲醛中，留作病理切片标本。

2 结 果

2.1超声监控观察 超声实时监控显示，对照组棘球蚴边缘回声欠清晰，内部存在一回声均匀的液性暗区(图1A)；HIFU辐照后，包囊边缘回声增强，内部出现点状回声增强(图1B)；UCA协同HIFU辐照后，包囊边缘回声增强，内部出现团状回声增强，且回声增强程度比单纯HIFU辐照更为显著(图1C)。

图1棘球蚴的超声实时监控图像

图A：对照组包囊超声图像；图B：单纯HIFU组包囊超声图像；图C：HIFU+UCA组包囊超声图像。

Fig.1UltrasoundimagesofhydatidcystsduringHIFUablation

A: Control, dark-shaded areas were observed and the edge of the cysts was irregular and unclear (cysts were shown by arrows);

B: Treated with HIFU alone, the borderline echo of hydatid cysts was clearer and the inner echo of cysts was enhanced in small range locally (cysts were shown by arrows);

C: Treated with 0.1 mL UCA+HIFU, the borderline echo of cysts was clearer and the inner echo of cysts was enhanced in small range locally. The ultrasound echo change of the cysts ablated with HIFU aided by UCA was more obvious than that of cysts ablated with 100 W HIFU alone (cysts were shown by arrows).

2.2肉眼观察 对照组棘球蚴囊壁布满“白砂状”育囊(图2A)；经HIFU辐照后，育囊明显减少，且很多残留的育囊从生发层脱落，囊壁变软(图2B)；UCA协同HIFU辐照后，肉眼未见育囊，囊壁变软，卷曲(图2C)。

2.3囊壁病理观察 正常棘球蚴囊壁的角质层规则、平滑且不易着色，生发层清晰，核清晰可见(图3A)；HIFU辐照后，生发层遭到严重破坏，仅有少量残留，核消失，角质层增粗，紊乱，扭曲，易着色(图3B)；UCA协同HIFU辐照后，生发层几乎无残留，角质层增粗，紊乱，扭曲，部分出现断裂(图3C)。

2.4扫描电镜观察 正常棘球蚴囊壁表面生发层布满育囊，未见生发层(图4A)；HIFU辐照后，生发层遭到破坏，可观察到扭曲的角质层(图4B)；UCA协同HIFU辐照后，生发层仅残留少数碎片，角质层遭到严重破坏，表面数层出现缺损(图4C)。

2.5透射电镜观察 正常的棘球蚴囊壁角质层纹理规则，光滑，致密，生发层的细胞核和细胞器清晰，形态正常(图5A)；HIFU辐照后，角质层纹理增粗，紊乱，偶见生发层及变形的细胞器(图5B)；UCA协同HIFU辐照后，角质层纹理增粗，紊乱，出现断裂。未见生发层及细胞器(图5C)。

图2棘球蚴囊壁的肉眼观察

图A：对照组包囊内囊肉眼观；图B：单纯HIFU组包囊内囊肉眼观；图C：HIFU+UCA组包囊内囊肉眼观。

Fig.2GrossobservationofcystwallsafterHIFUablation

A: Control, germinal layer was covered with brood capsules;

B: Treated with HIFU alone, the number of brood capsule was decreased obviously, and some residual brood capsules sloughed from germinal layer;

C: Treated with 0.1 mL UCA+HIFU, brood capsule was not observed, cyst walls were softened and curly.

图3囊壁的病理观察(×100)

图A：对照组包囊囊壁病理观察；图B：单纯HIFU组包囊囊壁病理观察；图C：HIFU+UCA组包囊囊壁病理观察。

Fig.3PathologicalchangesofcystwallsafterHIFUablation(×100)

A: Control, the laminated layer was clear and uniform (L), and its germinal layer with clear structure and visible nuclei (G);

B: Treated with HIFU alone, the laminated layer with rough veins and uneven spacing (L), and its germinal layer with unclear structure and nuclei disappeared (G);

C: Treated with 0.1 mL UCA+HIFU, the laminated layer, incrassation in veins, rough, and curved (L), and its germinal layer nearly disappeared (G).

图4囊壁扫描电镜观察

图A：对照组包囊囊壁扫描电镜观察；图B：单纯HIFU组包囊囊壁扫描电镜观察；

图C：HIFU+UCA组包囊囊壁扫描电镜观察。

Fig.4StructuresofcystwallsafterHIFUablationunderscanningelectronmicroscope

A: Control, the germinal layer surface of the vesicle wall was densely covered by parasite tissue (L),×1 000;

B: Treated with HIFU alone, the germinal layer was destroyed (G) and the twisting laminated layer could be observed,×200;

C: Treated with 0.1 mL UCA+HIFU, a little fragment of germinal layer and laminated layer defect (L) could be observed,×250.

图5囊壁透射电镜观察

图A：对照组包囊囊壁透射电镜观察；图B：单纯HIFU组包囊囊壁透射电镜观察；图C：HIFU+UCA组包囊囊壁透射电镜观察。

Fig.5StructuresofcystwallsafterHIFUablationundertransmissionelectronmicroscope

A: Control, the laminated layer was clear and uniform (L), the germinal layer with clear structure, and organelle structure were normal (G),×7 000;

B: Treated with HIFU alone, the laminated layer with rough veins and uneven spacing (L),×4 000;

C: Treated with 0.1 mL UCA+HIFU, the laminated layer, incrassation in veins, rough, and curved (L), and its germinal layer nearly disappeared,×5 000.

3 讨 论

当前，囊型包虫病的治疗方式主要有手术治疗、药物治疗和介入治疗3种方式[5]。由于囊壁的阻隔作用，药物难以在棘球蚴内部达到有效的作用浓度，从而影响治疗效果。因此 ，药物只是包虫病的辅助治疗手段，手术仍然是包虫病最主要的治疗方式。手术主要包括内囊摘除术和囊肿完全切除术，虽然手术技术有了提高，但是手术创伤过大，且术后包虫病复发率较高[6]。近年来，微创介入已经应用于包虫病的治疗。虽然仍不能完全避免残留原头节和生发层引起的包虫病复发，但该方法具有创伤性小恢复快的优点，因此，包虫病的微创治疗已经成为当前的研究热点[7]。

本项目组发现，HIFU对离体原头节和棘球蚴均有一定的杀伤作用[3,8]。HIFU是一种新兴的治疗技术，已经用于肿瘤的治疗。其原理主要是将声波能量聚焦于靶点，通过热效应和空化效应使治疗靶点产生凝固性坏死而不损伤周围的正常组织[9]。由于其具有非侵入性的优点，将其引入包虫病的治疗可以避免原头节的泄漏引起的继发性感染。但是由于棘球蚴内部充满囊液，使超声能量不能在囊内聚焦，导致一定治疗剂量的HIFU对棘球蚴的杀伤效果欠佳。提高HIFU功率或者延长治疗时间可完全杀灭棘球蚴，但此举会同时增加HIFU治疗时并发症(如正常组织灼伤和麻醉意外等)的发生率。

为提高HIFU的杀伤效应，我们将UCA作为增效剂引入HIFU杀伤棘球蚴的研究，结果发现，虽然单纯加入UCA对棘球蚴并无杀伤作用，但UCA可在不提高HIFU治疗剂量的前提下，通过增强HIFU的空化效应来提高HIFU对离体原头节和棘球蚴的杀伤效果[4,10]。因包虫病的复发主要是由于残留的原头节和囊壁所导致，为探索UCA作为HIFU增效剂进行包虫病治疗的可行性，有必要对UCA协同HIFU辐照后囊壁的损伤情况进行观察。

为更好的观察UCA对HIFU破坏棘球蚴囊壁的增效作用，根据前期结果，本文选取HIFU功率为100 W、UCA量为0.1 mL进行试验[3-4]。结果发现，一定功率的HIFU可对棘球蚴囊壁的生发层和角质层造成一定程度的破坏，但是生发层仍有残留，联用UCA后，生发层基本无残余,角质层也遭到了更为严重的破坏。研究认为，超声监控能显示治疗有效的特征性表现，通过观察超声的灰度值变化，可以间接的指导制定治疗剂量和判断治疗效果[11]。本试验发现联用UCA后，超声图像灰度增强比单纯HIFU辐照增强更为显著，间接证明了UCA可增强HIFU对离体棘球蚴的杀伤作用。Yang认为UCA主要通过增强HIFU的空化效应来提高其治疗效果[12]。分析联用UCA后，HIFU辐照可使囊壁破坏加重的原因，认为UCA的引入，增加了空化核的数量，HIFU辐照使微泡爆炸，产生更大的能量，使囊壁的蛋白和纤维发生不可逆的损伤，从而破坏囊壁。

UCA在临床上主要用于超声图像显影的增强，其安全性已被证实。动物实验时，可将UCA以静脉注射的方式注入动物体内，因此，将UCA作为增效剂引入HIFU治疗包虫病有以下优点：HIFU治疗是非侵入性治疗，患者痛苦小，恢复快, 还可避免手术或介入治疗时原头节泄漏引起的包虫病复发；UCA可使HIFU的超声监控图像更为清晰，有利于治疗靶点的定位；UCA联合HIFU辐照所致的囊壁角质层遭到破坏，可能有利于药物穿过囊壁，提高囊内的药物浓度，从而提高药物治疗效果。因此，UCA可增强HIFU对离体棘球蚴内原头节的杀伤效果，并能提高HIFU对棘球蚴囊壁的破坏作用，为进一步的动物试验奠定了基础。

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