白腐乳及其生产过程中蜡样芽孢杆菌的污染及防治

周婷婷，易敏英，相大鹏，李 理*

（1.华南理工大学 轻工与食品学院，广东 广州 510640；2.广东出入境检验检疫局，广东 广州 510623）

豆腐乳被誉为是中国的大豆奶酪，是豆腐经毛霉发酵、盐腌后熟而制成的一种食品，可佐餐，亦可调味。中国是腐乳的发源地，各地腐乳具有不同的风味特色[1]，受到消费者的欢迎。由于腐乳是敞开式发酵，且大多为传统的手工操作，因此很容易受到各种环境微生物的污染[2-3]，从而影响产品的品质，甚至对消费者的安全带来隐患。蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种条件致病菌，通常当其在食物中的含量超过105CFU/g（mL）时就有可能带来中毒症状。患者感染了蜡样芽孢杆菌，通常会产生呕吐、腹泻等症状，同时伴有头晕、恶心、发热，肠毒素和呕吐毒素是引起上述症状的主要原因。该菌抗逆性强在环境中分布极为广泛，是腐乳生产中常见的污染菌[4-5]。该实验研究了白腐乳中蜡样芽孢杆菌的污染状况，并进一步分析了某品牌腐乳生产环节中的污染状况，为腐乳生产的安全性改善提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白腐乳样品：市售；生产环节的半成品（包括生豆浆、熟豆浆、黄浆水、酸浆水、豆腐、种水、毛坯、盐坯、盐水及后熟等样品）：某品牌生产厂家；营养肉汤、营养琼脂、平板计数琼脂、甘露醇卵黄多黏菌素琼脂培养基（mannitol yolk polymyxin agar base，MYP）（一次性成品培养基）、血平板培养基（一次性成品培养基）：广东环凯微生物科技有限公司；API 50 CHB/E 培养基：法国生物梅里埃公司；AgNO3：天津博迪化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

JJ500电子天平：浙江余姚纪铭称重校验设备有限公司；YXQ-SG46-280S手提式高温灭菌锅：合肥华泰医疗设备有限公司；SW-CJ-ID单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱：上海申贤恒温设备厂；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；HSG-IB-2电热恒温水浴锅：常州奥华仪器有限公司；DensiCHEKPlus数字显示电子比浊仪：法国生物梅里埃公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌落总数的检测方法[6]

在无菌操作室内对样品进行处理，用研钵将样品充分的研磨，称取25g（量取25mL）处理好的待测样品于225mL、8.5%的无菌生理盐水中进行稀释。选择3个合适稀释度的菌悬液，吸入1mL菌悬液于无菌培养皿中，每个菌悬液测两个平行，然后向每个无菌培养皿中倾注15～20mL平板计数琼脂培养基（约46℃）并混匀。待琼脂凝固后翻转平板，置于37℃培养箱中培养（48±2）h后计数。每克或每毫升样品中所含的菌落总数的计算公式如下：

式中：N为样品菌落总数，CFU/g；∑C为适宜计数范围内平板菌落数之和；n1和n2分别为第一个和第二个适宜稀释度平板数；d为稀释因子。

1.3.2 蜡样芽孢杆菌总数的检测方法[7]

样品处理及稀释同1.3.1，选取3个合适的稀释度，分别吸取0.1mL菌悬液于MYP选择性培养基中，每个稀释度测2个平行，用L型涂布棒均匀涂布，37℃培养（12～20）h后计数。根据国家标准，蜡样芽孢杆菌在MYP平板上的典型菌落为粉红色（表示不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。挑取5个可疑的蜡样芽孢杆菌菌落进行生化鉴定分析。若经生化鉴定检测出其中A个菌落为蜡样芽孢杆菌，此稀释度共有B个可疑的蜡样芽孢杆菌菌落，则每克或每毫升样品所含蜡样芽孢杆菌数计算公式如下：

式中：X为样品蜡样芽孢杆菌数，CFU/g；A为挑取的5个疑似蜡样芽孢杆菌菌落中，经生化鉴定分析确信为蜡样芽孢杆菌的菌落数；B为该稀释度下可疑蜡样芽孢杆菌的总数；10为吸取0.1mL菌悬液进行涂布的稀释倍数。

1.3.3 蜡样芽孢杆菌的生化鉴定[8]

试验采用API 50 CHB/E试剂盒对蜡样芽孢杆菌进行生化鉴定。该试剂盒是一种快速检测培养基，它含有50种发酵作用的糖API 50CH试验条。首先将需要鉴定的蜡样芽孢杆菌可疑菌落分离纯化，并在血平板培养基上面富集培养，刮下菌胎于特殊培养液制成浊度≥2.0麦氏单位的菌悬液，接种于试剂条的每一个管，在30℃条件下培养24h后阅读试剂条。由于糖发酵产酸，使试剂条变色，然后以阴性（－）、阳性（＋）、可疑（?）记录每一个试验结果，将结果记录在结果判读单上。继续培养24h，再次记录每个生化反应的结果。将两次判读的结果都输入ApiLab软件（生物梅里埃，法国）进行鉴定分型。

1.3.4 氯化钠含量的测定方法[9]

取适量待测样品于研钵中研磨，转8g研磨好的样品于小烧杯中，加少量60℃的温水溶解搅拌，并于电炉上加热煮沸，一边搅拌一边冷却至室温，然后转入100mL容量瓶中定容，混匀，测定盐含量前可用滤纸进行过滤。

配制0.100mol/L的硝酸银标准液，以络酸钾作为指示剂。吸取2.0mL样品液于锥形瓶中，加入50mL蒸馏水及2滴络酸钾指示剂，摇匀，用硝酸银标准液滴定至刚刚出现砖红色，同时做空白对照，食盐含量的计算公式如下：

式中：X为食盐含量，g/100g；V1为测试样品时消耗硝酸银标准滴定液的体积，mL；V2为空白对照所消耗的硝酸银标准滴定液的体积，mL；C为硝酸银标准滴定液的浓度，mol/L；m为称取样品的质量，g；0.058 5为1.00mL硝酸银标准液的浓度相当于氯化钠的质量，g。

1.3.5 水分含量的测定方法[1]

取一块腐乳，放在漏斗上10min左右滤去卤汤，在研钵中充分研磨，称取研磨好的样品5g左右，在烘干至质量恒定的称量瓶中平铺，加盖，精密称量。置于105℃烘箱内，干燥4h，加盖置于干燥器中冷却0.5h后称量，然后再干燥1h，冷却0.5h后再称量，直到两次称量差＜2mg即为恒质量，水分含量的计算公式如下：

式中：m1为称量瓶和样品的质量，g；m2为称量瓶和样品干燥后的质量，g；m3为称量瓶的质量，g。

2 结果与分析

2.1 腐乳细菌总数及蜡样芽孢杆菌数分析

白腐乳样品菌落总数及蜡样芽孢杆菌的检测结果见表1。

表1 白腐乳中细菌总数、蜡样芽孢杆菌数及盐含量、水分含量的分析Table 1 Analysis of total bacterial count, Bacillus cereus count,salt content and water content in sufu

由表1可知，所检测的白腐乳样品菌落总数在102～106CFU/g。菌落总数较高主要是腐乳的生产至今仍然遵循传统手工生产工艺，生产模式较为粗放，生产车间密封性差，操作人员卫生管理不严格等原因导致的[10]。在抽检的10个白腐乳样品中，有7个样品检出了蜡样芽孢杆菌，检出率为70%，其中有2个样品的蜡样芽孢杆菌数达到106CFU/g。我国并没有现行的对腐乳中蜡样芽孢杆菌含量限制的标准，所以，通常采用腐乳出口其他国家时，其他国家地区对蜡样芽孢杆菌的限量标准来规范。例如香港，就按照即食食品微生物含量指引规定，当蜡样芽孢杆菌≥105CFU/g为不可接受[11]。以出口香港蜡样芽孢杆菌限量为标准，此次对腐乳的检测结果显示蜡样芽孢杆菌超标率为30%。

由表1还可以得出，腐乳中的食盐含量基本在6～11g/100g，腐乳中的蜡样芽孢杆菌数并未随着食盐含量的变化产生明显的规律性，这说明食盐含量对腐乳中蜡样芽孢杆菌的抑制还受其他因素的影响。水分含量也在一定程度上影响白腐乳中蜡样芽孢杆菌的生长，水分含量低的样品蜡样芽孢杆菌数也较低，其中一些以油为汤汁的腐乳样品中蜡样芽孢含量较低，甚至未检出，说明降低水分含量及油脂可以有效控制腐乳样品中蜡样芽孢含量。

2.2 白腐乳中间产品的细菌总数及蜡样芽孢杆菌数分析

2.2.1 白腐乳前期发酵中间产品的细菌总数及蜡样芽孢杆菌数分析

为了探明腐乳中蜡样芽孢杆菌的污染途径，本研究从某品牌生产厂家现场采集不同阶段的中间产品共9个样品，并重复3次，检测其细菌总数及蜡样芽孢杆菌数，以期在源头上控制其数量，其中间产品的细菌总数分析结果见表2，蜡样芽孢杆菌数分析结果见表3。

表2 腐乳中间产品的细菌总数分析Table 2 Total bacterial count in the semi-finished products of sufu

由表2可知，在腐乳的整个生产过程中，菌落总数一直处于较高的水平，3批样品的菌落总数平行度很高。在生豆浆中检出的菌落总数就已达到108CFU/mL，煮浆后菌落总数降到106CFU/mL，说明加热能够杀死部分不耐热的细菌；不过，在豆腐的点卤过程中，酸浆水又引入了部分杂菌，使得豆腐坯中细菌数又有所升高，达到105CFU/g，说明酸浆水是引入细菌的重要环节。通过接种、培菌，毛坯中的细菌数进一步增加，达到109CFU/g；经过后续的搓毛和盐腌步骤，细菌数仅有小幅度下降；最后，浸泡豆腐所用到的盐水中也有很高的细菌数，这主要是因为，浸泡盐坯所使用的盐水为多次重复利用，即将上一批浸泡过腐乳的盐水回收重新灌装到下一批盐坯，所以如果上一批样品污染了杂菌则会将细菌带入后一批的腐乳产品中[12]。

表3 腐乳中间产品的蜡样芽孢杆菌数分析Table 3 Bacillus cereus count in semi-finished products of sufu

由表3可知，3批样品中蜡样芽孢杆菌数的平行度较高。在3批生豆浆中都未检测出蜡样芽孢杆菌，但在后两批样品的熟豆浆中就已检测出蜡样芽孢杆菌，不过含量并不高，这说明蜡样芽孢杆菌可能来自于设备的管道污染。表3结果表明，蜡样芽孢杆菌污染腐乳的主要中间产品为酸浆水、种水和盐水。通过对生产现场观察发现，黄浆水为敞开式自然发酵，因此易被环境污染。此外，由于使用传统工艺及盐水的循环利用，使得种水和盐水中蜡样芽孢杆菌处于较高的水平。当使用这样的酸浆水来凝乳时，所获得的豆腐乳也就含有蜡样芽孢杆菌，再通过接种和培菌，毛坯中的蜡样芽孢杆菌可以增殖定到一个很高的水平。由此可见，要想控制最终产品中的蜡样芽孢杆菌数量，必须从酸浆水、种水和盐水几个环节着手。

2.2.2 腐乳后期发酵中产品的细菌总数及蜡样芽孢杆菌数分析

表4 腐乳后发酵阶段菌落总数和蜡样芽孢数检测结果Table 4 Detection results of total bacterial count and Bacillus cereus in the secondary fermentation

由表4可知，经过45d的后期发酵，腐乳中的菌落总数以及蜡样芽孢杆菌的数量均呈下降趋势。这是因为腐乳盐坯中盐含量很高，在浸入卤汤后一段时间达到瓶内盐含量平衡，较高的盐含量能够抑制细菌的生长。不过值得注意的是，细菌总数还是蜡样芽孢杆菌数的下降空间都是有限的，仅仅是1～2个数量级的差异。经过后期发酵，起始蜡样芽孢总数为105CFU/g的产品在出厂前降至103CFU/g，在安全限量以下，所以在前期生产结束后盐坯中蜡样芽孢杆菌应尽可能控制在≤105CFU/g。

2.2.3 腐乳生产中蜡样芽孢杆菌的控制措施

由上述检测结果可以得出，腐乳生产过程中蜡样芽孢杆菌的污染环节主要是酸浆水的发酵、豆腐的压制、种水的喷洒以及盐水浸泡过程。所以，有必要在前期生产过程中将蜡样芽孢杆菌降低到最低范围以保证后期发酵时蜡样芽孢杆菌处于安全水平，针对这几个关键的污染环节，提出以下几点针对性的控制措施。

首先，加强生产现场的监测，酸浆水、种水和盐水的蜡样芽孢杆菌水平要重点监控，一旦发现升高的迹象即迅速采取措施控制。由于生产中将黄浆水敞开放置隔夜，第二天发酵成酸浆水，酸浆水通过贴近地面的半封闭式管道流入下一生产步骤，用于点豆腐。但由于黄浆水营养丰富，易于变质，敞开放置隔夜后可能会有大量的有害微生物滋长；发酵形成酸浆水后，酸浆水贴近地面流动，很容易将土壤和空气中的蜡样芽孢杆菌带入产品引起污染。所以应该采用密封容器盛放黄浆水，酸浆水应在封闭的管道内流动以避免细菌落入，除此之外，由于黄浆水要放置隔夜，还要对黄浆水进行灭菌，但因为黄浆水中还含有凝固豆腐所需的乳酸菌和酵母菌，不能采取加热煮沸的方式来杀菌，可选取一些选择性强的天然抑菌剂，针对性地减少或杀灭酸浆水中的蜡样芽孢杆菌。种水和盐水现配先用，争取将蜡样芽孢杆菌抑制至最低水平。

其次，选择有效的消毒方法。目前，在所有的消毒灭菌的方法中，应用得最广泛的是热力灭菌，但由于蜡样芽孢杆菌含有内生孢子，耐热性强，用传统的加热煮沸方式不能达到良好的效果。如果使用具有光滑表面的设备，则应用洗涤剂清洁、流水冲洗可能更有效。当然，最有效的办法是筛选到针对蜡样芽孢杆菌的杀菌剂，如有报道表明过氧乙酸和二氧化氯对蜡样芽孢杆菌有很好的杀灭效果[13]。此外，一些天然的香辛料提取物如大蒜精油也具有杀灭、抑制蜡样芽孢杆菌的作用[14]。

第三，加强菌种管理。虽然采用传统的自然发酵可以制备出风味独特稳定的腐乳产品，但仍需要在风味和安全性方面取得平衡，对菌种进行分离、纯化及妥善保藏都是有必要的[15]。

3 结论

检测白腐乳及其生产的各个环节中样品的菌落总数和蜡样芽孢杆菌数。结果表明，白腐乳中蜡样芽孢杆菌的检出率为70%，其中30%的样品超出港标的要求。分析了腐乳中蜡样芽孢杆菌的主要污染来源和污染途径。在腐乳的生产过程中，蜡样芽孢杆菌主要通过酸浆水、种水、盐水污染产品，需在生产中加以控制。通过检测蜡样芽孢杆菌在腐乳后发酵阶段的变化情况，发现成品腐乳的菌落总数和蜡样芽孢杆菌数有一定的下降，后发酵开始之前蜡样芽孢杆菌数为105CFU/g的产品在后发酵结束降至103CFU/g，说明如果将前期产品中的蜡样芽孢杆菌控制在一定范围内，经过后发酵过程，腐乳中的蜡样芽孢杆菌即可达到出口香港要求。根据对蜡样芽孢杆菌在腐乳生产过程中的污染情况调查，建议从加强现场监测、加强菌种管理及选择有效消毒方法等方面降低产品中的蜡样芽孢杆菌数。

[1]王瑞芝.中国腐乳酿造[M].北京：中国轻工业出版社，2009.

[2]HAN B Z,ROMBUSTS F M,NOUT M J.A Chinese fermented soybean food[J].Int J Food Microbiol,2001,65(1-2):1-10.

[3]ROY A,MOKTAN B,SARKAR P K.Microbiological quality of legume-based traditional fermented foods marketed in West Bengal,India[J].Food Control,2007,18(11):1405-1411.

[4]HAN B Z,CAO C F,ROMBUSTS F M,et al.Microbial changes during the production of Sufu-a Chinese fermented soybean food[J].Food Control,2004,15(4):265-270.

[5]张金兰，鲁 绯，张伟伟.腐乳中蜡样芽孢杆菌污染情况的调查分析[J].中国酿造，2010，29（10）：15-18.

[6]中华人民共和国卫生部.GB 4789.2—2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

[7]中华人民共和国卫生部.GB 4789.14—2003 食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验[S].北京：中国标准出版社，2003.

[8]李 琳，李槿年，余为一.细菌分类鉴定方法的研究概况[J].安徽农业科学，2004，32（3）：549-551.

[9]中华人民共和国国家质量监督检验检疫局.GB/T 12457—2008 食品中氯化钠的测定[S].北京：中国标准出版社，2008.

[10]徐海蒂，程永强，许永伟.发酵菌种对低盐白腐乳感官品质的影响[J].食品与发酵工业，2007，33（10）：17-22.

[11]即食食品微生物指引（香港）[S].香港：食物环境卫生署，2001.

[12]高秀芝，王小芬，李献梅.传统发酵豆酱与商品豆酱养分及微生物多样性比较[J].食品科学，2009，30（3）：222-226.

[13]莫金观，邓金花，黄 静.不同消毒剂对蜡样芽孢杆菌的杀灭效果比较[J].中国消毒学杂志，2008，25（6）：672-673.

[14]穆可云，李 理.蜡样芽胞杆菌生长特性及大蒜精油对其抑菌活性的研究[J].中国酿造，2012，31（12）：131-134.

[15]Villanueva L,Ibis JZD,Dayao AS.Potential of Bacillus subtilis against powder mildew of garden pea[C].Recent advances in biofertilizers and biofungicides (PGPR) for sustainable agriculture Proceedings of 3rd Asian Conference on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR)and other Microbials,Manila,Philippines,2013,38-49.