陈皮不同提取物及橙皮苷部位的抗炎活性比较研究

贺燕林，杨中林

(中国药科大学 天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京210009)



陈皮不同提取物及橙皮苷部位的抗炎活性比较研究

贺燕林，杨中林*

(中国药科大学 天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京210009)

目的：比较研究陈皮醇提物、陈皮水提物及橙皮苷部位的抗炎活性。方法：用1μg/mL的脂多糖(LPS)处理RAW264.7细胞，建立炎症模型，采用NO试剂盒检测各实验样品对模型细胞NO释放量的影响；采用MTT法测定细胞活力。结果及结论：陈皮醇提物、陈皮水提物及橙皮苷部位均具有显著抗炎活性，且陈皮醇提物、陈皮水提物的抗炎活性优于橙皮苷部位。

陈皮醇提物；陈皮水提物；橙皮苷部位；抗炎

陈皮(Pericarpium Citri Reticulatae)为芸香科植物橘(CitursreticulataBlanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮，主要含有黄酮、类柠檬苦素、挥发油等化学成分。黄酮类成分包括：橙皮苷、新陈皮苷、柑橘素等，其中橙皮苷为主要成分[1]。《中国药典》记载陈皮具有理气健脾、燥湿化痰等作用，临床主要用于胸脘胀满、食少吐泻、咳嗽痰多等症[2]。目前对于陈皮抗炎作用的研究很少，本次实验采用LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型[3]，以模型细胞NO释放量为指标，比较研究陈皮醇提物、陈皮水提物及橙皮苷部位的抗炎活性，为进一步开发利用中药陈皮提供实验依据。

1 实验材料

1.1 细胞

RAW264.7细胞(中国药科大学新药筛选中心惠赠)。

1.2 试药与试剂

陈皮饮片(产地江苏，购自先声药店，经本人鉴定为芸香科植物橘CitursreticulataBlanco的干燥成熟果皮)；95%乙醇(分析纯，南京鼎新化工轻工有限公司)；脂多糖(Sigma公司)；一氧化氮试剂盒(南京建成生物工程研究所)；胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)；二甲亚砜(分析纯，南京化学试剂有限公司)；四氮甲唑蓝(南京化学试剂有限公司)；胰蛋白酶(美国Gibco公司)。

1.3 仪器与设备

0412-1型低速离心机(上海医疗器械有限公司)；BS124型电子天平(Sartorius Corporation，Germany)；超净工作台(苏州艾可林净化设备有限公司)；HERA Cell 150型恒温培养箱(Kendro Laboratory Products，Germany)；RT-6000型酶标分析仪(深圳书社生命科学股份有限公司)；HH-4型恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；COICXDS-1B型倒置光学显微镜(重庆光电仪器有限公司)；YXQ·SG41·280型电热手提压力蒸汽消毒器(上海医用核子仪器厂)；79-1型磁力搅拌器(深圳国华仪器有限公司)；培养皿、培养板(Corstar Corporation，USA)。

2 实验方法

2.1 陈皮醇提物、陈皮水提物、橙皮苷部位制备

2.1.1 陈皮醇提物制备 准确称取12.2g陈皮饮片置250mL圆底烧瓶中，溶媒为80%乙醇溶液，浸泡2h。共提取3次，第1次用10倍量溶媒提取2h，第2次用10倍量溶媒提取1h，第3次用10倍量溶媒提取1h，提取液8层纱布过滤后合并，减压浓缩至无醇味，再将药液置于水浴锅上挥去水分(90℃)，真空干燥箱中干燥至衡重，得陈皮醇提物4.4g。陈皮醇提物得率=醇提物称量/药材称量×100%=4.4g/12.2g×100%=36.1%。

2.1.2 陈皮水提物制备 准确称取12.2g陈皮饮片置250mL圆底烧瓶中，溶媒为水，浸泡2h。共提取3次，第1次用10倍量溶媒提取2h，第2次用10倍量溶媒提取1h，第3次用10倍量溶媒提取1h，提取液8层纱布过滤后合并，将药液置于水浴锅上挥去水分(90℃)，真空干燥箱中干燥至衡重，得陈皮水提物4.9g，陈皮水提物得率=水提物称量/药材称量×100%=4.9g/12.2g×100%=40.1%。

2.1.3 橙皮苷部位制备 实验室前期采用醇提水沉等方法分离纯化制备，药材中该部位的得率为7%。经HPLC法测定，该部位中陈皮苷含量为45.90%。

2.2 试药配制

2.2.1 LPS造模剂溶液的配制 用十万分之一电子天平精密称取LPS粉末1mg置于1.5mL离心管中，加入DMEM高糖培养基1mL，震荡溶解。精密吸取0.1mL上述LPS溶液于15mL离心管中，加入9mL DMEM高糖培养基，混合均匀，得浓度为10μg/mL的LPS溶液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，密封保存备用。

2.2.2 陈皮醇提物溶液配制 用十万分之一电子天平精密称取陈皮醇提物5.18mg(按醇提物得率换算，相当于14mg生药材)，40μL DMSO震荡溶解，加入DMEM培养基0.96mL，混合均匀，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得浓度为5 180μg/mL的陈皮醇提物溶液。依次对半稀释，得浓度为2 590μg/mL、1 295μg/mL、647.5μg/mL的陈皮醇提物溶液，备用。

2.2.3 陈皮水提物溶液配制 用十万分之一电子天平精密称取陈皮水提物2.81mg(按水提物得率换算，相当于7mg生药材)，20μL DMSO震荡溶解，加入DMEM培养基0.98mL，混合均匀，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得浓度为2 810μg/mL的陈皮水提物溶液，备用。

2.2.4 橙皮苷部位溶液的配制 用十万分之一电子天平精密称取橙皮苷部位0.50mg(按橙皮苷部位得率换算，相当于7mg生药材)，20μL DMSO震荡溶解，加入DMEM培养基0.98mL，混合均匀，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得浓度为500μg/mL橙皮苷部位溶液，备用。

2.3 细胞给药浓度确定

2.3.1 细胞培养与分组 RAW264.7细胞在含有10%FBS、100μg·mL-1青霉素及100μg·mL-1链霉素的DEME高糖培养基中，置于含5%CO2、饱和湿度空气的培养箱37℃孵育，每2～3天传代1次。

实验时，将RAW264.7细胞按60 000个/mL密度接种于96孔板中，随机分为6组，每组设6个复孔：①空白对照组：每孔加入200μL DMEM高糖培养基；②LPS模型组：每孔加入180μL DMEM高糖培养基、20μL 10μg/mL的LPS溶液；③518μg/mL的陈皮醇提物组：每孔加入160μL DMEM高糖培养基、20μL 10μg/mL的 LPS溶液、20μL 5180μg/mL的陈皮醇提物溶液；④259μg/mL的陈皮醇提物组：每孔加入160μL DMEM高糖培养基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 2590μg/mL的陈皮醇提物溶液；⑤129.5μg/mL的陈皮醇提物组：每孔加入160μL DMEM高糖培养基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 1 295μg/mL的陈皮醇提物溶液；⑥64.75μg/mL的陈皮醇提物组：每孔加入160μL DMEM高糖培养基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 647.5μg/mL的陈皮醇提物溶液。

2.3.2 NO释放量测定 NO分泌量用NO试剂盒进行测定。NO在生理溶液中不稳定，大部分NO快速代谢成亚硝酸盐NO2-和NO3-。本试剂盒采用硝酸还原酶特异性地将NO3-还原为NO2-，NO2-与显色剂作用生成有色物质，用比色法测定NO2-浓度即代表NO水平。

将加药后的96孔板在培养箱中继续培养24h，用移液枪从每孔吸取100μL上清液，按NO试剂盒方法，酶标仪570nm测定培养板中各孔吸光度值。

2.3.3 细胞活力测定 细胞活力用MTT法进行测定。将细胞以60 000个/mL密度接种于96孔板中，按照“2.3.1”项下的方法分组培养24h后，移除培养液，每孔加入180μL新鲜的培养基和20μL MTT 溶液(5g·L-1)，孵育4h后吸出上清，每孔加入200μL DMSO，轻轻振荡10min，待蓝紫色结晶完全溶解后，用酶联免疫检测仪在492nm波长处测定各孔吸光度值。

2.4 陈皮醇提物、陈皮水提物及橙皮苷部位抗炎活性比较

RAW264.7细胞在含有10%FBS、100μg·mL-1青霉素及100μg·mL-1链霉素的DEME高糖培养基中，置于含5%CO2、饱和湿度空气的培养箱37℃孵育，每2～3天传代1次。

实验时，将RAW264.7细胞按60 000个/mL密度接种于96孔板中，随机分为6组，每组设6个复孔。①空白对照组：每孔加入200μL DMEM高糖培养基；②LPS模型组：每孔加入180μL DMEM高糖培养基、20μL 10μg/mL的LPS溶液；③陈皮水提物组：每孔加入160μL DMEM高糖培养基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 2810μg/mL的陈皮水提物溶液；④陈皮醇提物组：每孔加入160μL DMEM高糖培养基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 2 590μg/mL的陈皮醇提物溶液；⑤橙皮苷部位组：每孔加入160μL DMEM高糖培养基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 500μg/mL的橙皮苷部位溶液。

将加药后的96孔板在培养箱中继续培养24h，参照“2.3.2”项、“2.3.3”项下方法，测定模型细胞NO的释放量及细胞活力。

3 实验结果与分析

3.1 细胞给药浓度确定

NO分泌量用NO试剂盒进行测定。结果显示，造模组NO值明显升高，且与空白组作t检验的P值<0.01，说明造模成功。518μg/mL、259μg/mL陈皮醇提物组NO值明显降低，且与造模组作t检验的P值<0.01，说明518μg/mL、259μg/mL的陈皮醇提物具有极显著抗炎活性。129.5μg/mL陈皮醇提物给药组NO值明显降低，且与造模组作t检验的P值<0.05，说明129.5μg/mL的陈皮醇提物具有显著抗炎活性。64.75μg/mL的陈皮醇提物组NO值略有降低，与造模组作t检验的P值>0.05，说明64.75μg/mL的陈皮醇提物无明显的抗炎活性。具体结果见表1。

表1 不同浓度的陈皮醇提物对RAW264.7细胞NO释放量的影响

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05；与模型组比较，**P<0.01。

细胞活力用MTT法进行测定。结果显示，518μg/mL陈皮醇提物组细胞存活率降低，且与空白组作t检验的P值<0.05，说明518μg/mL陈皮醇提物具有一定的细胞毒性。259μg/mL、129.5μg/mL、64.75μg/mL的陈皮醇提物组与空白对照组比较，P值>0.05，说明上述3个浓度的陈皮醇提物对RAW264.7细胞活力无明显影响，具体结果见表2。

表2 不同浓度的陈皮醇提物对RAW264.7细胞活力的影响

注：与空白组比较，#P<0.05。

小结：以抗炎活性和对细胞活力的影响为指标，将抗炎活性比较研究中陈皮醇提物的细胞给药浓度确定为259μg/mL。

3.2 陈皮醇提物、陈皮水提物及橙皮苷部位对RAW264.7细胞NO释放量的影响

NO分泌量用NO试剂盒进行测定。结果显示，造模组NO值明显升高，且与空白组作t检验的P值<0.01，说明造模成功。各给药组与模型组比较，陈皮水提物给药组NO值明显降低，且与造模组作t检验的P值<0.01，说明281μg/mL的陈皮水提物具有极显著抗炎活性。陈皮醇提物给药组NO值明显降低，且与造模组作t检验的P值<0.01，说明259μg/mL的陈皮醇提物具有极显著抗炎活性。橙皮苷部位给药组NO值有一定的降低，且与造模组作t检验的P值<0.05，说明50μg/mL的橙皮苷部位具有显著性抗炎活性，具体结果见表3。NO抑制率=(模型组OD值-测定组OD值)/模型组OD值。

表3 陈皮醇提物、陈皮水提物及橙皮苷部位对RAW264.7细胞NO释放量的影响

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05；与模型组比较，**P<0.01。

3.3 陈皮醇提物、陈皮水提物及橙皮苷部位对RAW264.7细胞活力的影响

细胞活力用MTT法进行测定。结果显示，模型组、各

给药组与空白对照组比较，P>0.05，说明各个给药组对RAW264.7细胞活力均无明显影响，具体结果见表4。存活率=给药组OD值/空白组OD值×100%。

表4 陈皮醇提物、陈皮水提物及橙皮苷部位对RAW264.7细胞活力的影响

4 讨论

研究表明[4]，巨噬细胞受到外界刺激极易被激活引发炎症反应，炎症介质或致炎物可诱导或增加局部NO的合成和释放。本研究以LPS诱导巨噬细胞RAW264.7细胞建立炎症模型，以模型细胞NO释放量和细胞活力为指标，比较研究陈皮醇提物、陈皮水提物及橙皮苷部位的抗炎活性，方法简单，稳定可靠。

很多慢性疾病的发病机制都涉及炎症。因此，抗炎治疗成为预防和治疗各种疾病的重要途径[5-6]。本次研究表明，陈皮醇提物、陈皮水提物及橙皮苷部位均可显著降低模型细胞NO的释放量，具有显著抗炎活性。且通过各给药组组间比较可知，陈皮醇提物、陈皮水提物的抗炎活性优于橙皮苷部位，推测为陈皮提取物中多成分协同作用的结果。

[1] 郑小吉，詹晓如，王小平．陈皮研究进展[J]．中国现代中药，2007，9(10)：30-32．

[2] 王春燕．浅谈陈皮的药理作用及临床应用[J]．中国中医药现代远程教育，2013，11(3)：120-131．

[3] 李晓红，齐云，蔡润兰，等．芦荟大黄素对LPS诱导的RAW264.7细胞NO生成及iNOS表达的影响[J]．中国药理学通报，2010，26(4)：488-492．

[4] Li LP, Zhang JX, Li LF, et al. Effect of an inoguanidine on pulmonary apoptosis in the lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats[J].Chin Phamacol Bull,2007,23(1):28-32.

[5] L JUNG T,LUNDBERG S,VARSANYI M,et al.Rectal nitric oxide as biomarker in the treatment of inflammatory bowel disease responders versus nonresponders[J].World J Gastroenterol,2006,12(21):3386-3392.

[6] LALA PK,CHAKRABORTY C.Role of nitric oxide in carcinogenesis and tumour progression[J].Lancet Oncol,2001,2(3):149-156.

(责任编辑：宋勇刚)

2014-03-10

贺燕林(1989-)，女，中国药科大学硕士研究生，研究方向为中药新药研发。

杨中林(1950-)，女，中国药科大学教授，博士生导师，研究方向为中药新药研发。E-mail:yzl1950@126.com。

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1673-2197(2014)13-0023-03